【摘 要】
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该论文对阿维链霉菌遗传多样性和aveD缺失基因的克隆进行研究.基于目前国内外对阿维菌素的研究现状,将基因打靶技术应用于对阿维菌素产生菌的基因改造,并对具体的实验条件进
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该论文对阿维链霉菌遗传多样性和aveD缺失基因的克隆进行研究.基于目前国内外对阿维菌素的研究现状,将基因打靶技术应用于对阿维菌素产生菌的基因改造,并对具体的实验条件进行了初步的摸索,为敲除阿维链霉菌aveD基因,进一步遗传改造阿维链霉菌,构建高产工程菌,提高阿维菌素有效成分的产出奠定了技术基础.实验的第一部分是对阿维链霉菌突变株遗传多样性的研究.选用22株经离子束、亚硝基胍和太空搭载诱变筛选出的阿维菌素高产突变株与野生菌及出发菌株,采用了PCR技术扩增rpsL基因,用TGGE技术对扩增结果进行分析,对它们进行了遗传多样性分析.研究结果表明,14株菌与野生菌株4.1253对比都发生了突变,说明阿维菌素产量与rpsL基因突变有相关性.该实验的第二部分在阿维链霉菌aveD缺失基因的克隆研究中,采用开读框内(ORF)定点缺失技术,根据基因库中aveD基因上下游序列,设计了PCR扩增引物,摸索扩增条件,将纯化的aveD基因与pMD18-T连接转化E.coliDH5α,提取重组质粒,将其命名为pHD1.测序后分析aveD基因的酶切位点,发现突变株aveD基因发生突变,丧失了NalI酶切位点中的两个切点.因此,选用BssHⅡ切除了aveD基因中262bp的序列,获取了aveD基因内部缺失262bp的一段长为824bp的DNA片段,即aveD缺失基因,并通过转化E.coliDH5α成功地克隆了aveD缺失基因.
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