多药耐药(multidrug resistance ,MDR)是白血病等恶性肿瘤化疗失败的主要原因之一，也是恶性肿瘤常规化疗难以获得长期缓解的重要障碍。研究表明，由多药耐药基因-1（multidrug resistance gene-1，mdr-l）编码的p-糖蛋白(p-glycoprotein,P-gp)在肿瘤细胞表面过度表达是导致肿瘤细胞多药耐药的主要机制（1,2），也是逆转耐药的良好靶点（3）。目前逆转MDR策略先后有：作用于P－gp的传统药物，如维拉帕米和环胞霉素A 及其衍生物等，但临床治疗效果并不理想，主要是其毒副作用较大，有效药物浓度下产生严重不良反应，限制其临床应用。而针对P－gp的单克隆抗体，其逆转肿瘤MDR的试验目前大多未获成功，因为难以在肿瘤部位获得足量的抗体及抗体的免疫原性是临床应用单克隆抗体的一个障碍。因此逆转剂从传统的细胞毒性药物，发展到针对MDR发生发展的机制，寻找其分子作用靶点。反义核酸及核酶的研究较早，但由于只能部分阻断靶基因的转录，疗效仍存在着问题。可见,进一步研究白血病多药耐药的分子机制,寻找新的方法在分子水平控制mdr-1基因表达，有着重要的临床意义。而RNA干扰（RNA interference,RNAi）是近年兴起的高效且特异阻断特定基因的新技术，主要是将21bp的小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）转染进细胞，通过序列特异的降解作用，能<WP=8>有效封闭靶mRNA和降低蛋白质水平。本课题采用RNA干扰技术,以高表达mdr-1基因(4,5)、具有典型多药耐药特征的慢性粒细胞白血病急变细胞系K562/A02细胞为研究对象，分析RNAi对K562/A02细胞mdr1基因的抑制和耐药表型的逆转作用。主要的结果与结论如下： 1.首先是RNAi封闭mdr-1基因有效靶位点的筛选。针对mdr-1基因mRNA序列设计3条 21bp的siRNA（si-sequence1, si- sequence2, si- sequence3）及21bp与任何人基因无明显同源性的阴性对照序列(si-neg)， 以探讨RNAi对K562/A02对mdr1基因的抑制。siRNA用Cy3标记，在脂质体的介导下转染K562/A02细胞，筛选转染条件。siRNAs作用细胞后，用 RT-PCR分析 mdr-1 mRNA的表达，流式细胞术检测P-gp水平，发现si- sequence3对mdr1基因mRNA及P-gp蛋白抑制效果最为显著，表达水平明显下调。所以我们选择si- sequence3为mdr1基因的小干扰RNA （si-MDR1）开展后续的实验。2.小干扰RNA对白血病MDR细胞系K562/A02 mdr-1转录、P-gp表达、P-gp功能及K562/A02细胞耐药表型的影响，并进行RNAi的特异性分析。设计与si-MDR1仅有一个碱基突变的序列（si-MDR1-mut）为对照。RT-PCR 和Western blot 分析mdr1mRNA及P－gp蛋白水平，发现si-MDR1能将P－gp表达降低约60%，而si-MDR1-mut则不能阻断基因表达。流式细胞术分析细胞内柔红霉素积累量，四唑蓝快速比色法（MTT）检测K562/A02对阿霉素、长春新碱、足叶乙甙药物敏感性的变化。实验证实筛选出的si-MDR1能高效封闭K562/A02细胞内mdr-1基因表达，增加细胞内化疗药物柔<WP=9>红霉素积累量，重置K562/A02细胞对阿霉素、长春新碱、足叶乙甙的敏感性。证实RNAi可以通过抑制mdr1基因表达，来逆转K562/A02细胞耐药表型。而仅有一个碱基突变的对照序列则丧失RNA干扰作用。