人参锈腐病菌Ilyonectria robusta基因组与互作转录组分析及转化体系的建立

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人参是重要的药用经济作物,锈腐病(Ginseng rusty root rot)是人参生产上发生最为严重的常见根部病害,目前呈加重趋势,严重威胁人参产业的发展。目前人参锈腐病菌的基因组信息未见公布,缺少遗传转化体系,分子致病机制研究受到限制。因此,本文对人参锈腐病主要优势病原菌Ilyonectria robusta菌株CBLJ-3开展了全基因组测序、侵染过程内参基因筛选,侵染初期转录组测序以及转化条件进行了研究,研究结果为进一步开展锈腐病菌I.robusta与人参互作分子致病机制研究奠定了基础。主要研究结果如下:CBLJ-3菌株全基因组测序结果显示,全基因组包含106 contigs,总大小为66,097,632bp,GC含量为50.74%;共预测了15503条编码序列(CDSs),预测为分泌蛋白的有964个,分泌蛋白基因所占比例大约为6.22%,预测为效应蛋白基因的有121个;CBLJ-3菌株富含丰富碳水化合物活性酶类基因,推测可能与其致病性相关。以Act、Tub、H3、18Sr RNA、Tef、GAPDH和UBQ 7个基因作为候选基因,采用实时荧光定量PCR技术结合转录组测序验证结果开展了内参基因筛选研究,运用Best Keeper、ge Norm、Norm Finder和Ref Finder 4个软件综合评价候选内参基因的稳定性。结果表明,Act、Tub、Tef、GAPDH 4个内参基因稳定性较好,均可用于I.robusta侵染人参根基因的表达研究,其中Act基因最稳定。I.robusta侵染人参初期互作转录组分析表明,接种后48 h,差异表达基因共计6370个,接种后72 h,I.robusta表达的差异基因共计5919个;对差异基因进行GO和KEGG数据库富集分析发现,初侵染阶段参与能量代谢的基因较多,CBLJ-3可能产生次生代谢产物帮助其成功侵染寄主;CAZy数据库相关基因在侵染初期上调差异表达显著,尤其是PL类相关基因,推测其可能与致病性相关。对CBLJ-3菌株遗传转化体系进行了探索,优化了原生质体制备条件,发现1 m L的1×10~7个/m L的孢子悬浮液加入100 m LPSB中,25℃150 r/min,培养22 h更有利于原生质体的产生;0.7 mol/L KCl+0.7 mol/L Mg SO4·7H2O为稳定剂酶解菌丝,32℃,150r/min酶解3 h条件下获得较多高质量的原生质体。运用PMT和REMI两种转化方法对CBLJ-3菌株进行了转化,发现两种转化方法都存在较高的假阳性,REMI转化方法获得了一个较为稳定的转化子G121,遗传稳定性较高。
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