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低温、干旱和土地盐渍化等非生物胁迫给作物生长发育及其产量带来了严重的影响。AP2/EREBP转录因子在植物中是特有的,在响应调节逆境胁迫方面起着至关重要的作用。近年来AP2/EREBP转录因子相继从多种作物中被克隆出来。当前的研究主要集中在DREB、AP2和ERF三个亚族。其中,DREB类转录因子是一类与植物逆境胁迫响应相关的重要蛋白。因此本研究利用同源克隆方法和RACE技术从紫大麦草(Hordeumviolaceum),中分离到两个DREB类转录因子基因,为利用基因工程技术来增强作物抗逆能力和转基因育种提供基因资源。研究手段及结果如下:
1.通过RT-PCR获得该基因的保守片段,利用RACE技术获得了1060bp的cDNA序列,包含一个792bp的完整开放阅读框,编码264个氨基酸残基,含有一个保守的AP2结构域,属于AP2大家族。命名为Hvi917DREB2,基因登录号为:JQ693159。此外,利用同源克隆的技术从紫大麦草中分离了另外一个DREB类转录因子基因,命名为Hvi020DREB,该基因长1137bp,包含一个长837bp的完整开放阅读框。
2.生物信息学分析,Hvi917DREB2无跨膜域和信号肽;亚细胞定位预测为核蛋白且为亲水蛋白;该蛋白具有脂肪酸代谢,辅因子生成及氨基酸生物合成等功能。
3.该基因编码的氨基酸序列与Genebank中短芒大麦草AP2蛋白HbDREB2、DREB1(登录号分别为:AAU29412.1和AER42620.1),具有99%的氨基酸序列一致性。通过构建氨基酸系统进化树分析发现该基因编码的氨基酸与短芒大麦草的亲缘关系最近,与之聚为了一类。
4.将该基因构建成原核表达载体,经IPTG诱导表达了1个分子量为34.5kD的蛋白。