论文部分内容阅读
肿瘤药物的体内靶向运输是目前肿瘤治疗研究的一大热点。我们在前期研究中发现了一种能够与肿瘤细胞表面高表达的EGFR专一性结合的靶向运输载体S3-HBD，其能够与人宫颈癌细胞(HeLa)专一性的结合，但对其他肿瘤细胞靶向结合能力较弱。本研究将对这一靶向运输载体进行进一步的优化改造，以期扩大其肿瘤细胞识别的类型和靶向运输的效率。 S3-HBD肿瘤靶向肽中有两个功能域，其中HBD来源于人胞外SOD的肝素结合域，S3来源于牛痘病毒生长因子中与EGFR识别和结合的结构域。这两个结构域分别通过其与肿瘤细胞表面的蛋白多糖和高表达的表皮生长因子受体相互作用，产生一种对肿瘤细胞高效的协同识别和结合效应，从而可以被用作为肿瘤药物靶向运输载体。 在人体内可以与EGFR结合的EGF样配体中，还存在一种被称为肝素样表皮生长因子(HB-EGF)的配体，其往往在肿瘤细胞中也存在过表达现象。HB-EGF与普通的EGF类生长因子相比，其分子内多了一个肝素结合域(HE），因此这种生长因子可同时识别细胞表面的EGFRs和肝素多糖并与之发生相互作用。为了进一步提高S3对肿瘤细胞的特异性识别和结合能力，本研究将S3结构域与HB-EGF来源的HE进行融合表达，观察其对新形成的靶向肽的肿瘤识别能力。期望通过新引入的HE，进一步强化靶向肽与肿瘤细胞表面过表达的EGFR特异性结合能力，同时也保留了HE结构域与细胞表面肝素多糖的结合能力，使得该融合多肽对肿瘤细胞具有更优异的靶向性能。 本研究将重组表达和纯化EGFP-S3-HE融合蛋白与正常细胞和肿瘤细胞的共孵育，来验证S3-HE对肿瘤细胞的特异性靶向吸附能力。荧光显微镜观察和流式细胞术分析发现，2μM EGFP-S3-HE在HeLa细胞中的荧光量是EGFP-S3-HBD的2.8倍。并且EGFP-S3-HE对B16，95D，A549和MB-MBA231等肿瘤细胞株都呈现出显著的结合能力，而EGFP-S3-HBD对这四种肿瘤细胞都没有明显的结合能力。表明S3-HE对肿瘤特异性识别结合能力比前期的S3-HBD有显著提升。同时，EGFP-S3-HE和EGFP-S3-HBD一样，都对正常细胞MRC-5没有明显的识别结合。 在新构建的S3-HE靶向肽的基础上，本研究进一步将穿膜肽TATm（一种对经典TAT穿膜肽进行突变改造，调整其穿膜功能的突变型TAT穿膜肽，其具有比经典TAT更温和的穿膜性能）与S3-HE融合，获得一种新型肿瘤靶向型运输载体S3-HE-TATm。流式细胞术分析结果表明，1μM EGFP-S3-HE-TATm在HeLa细胞中的荧光量是EGFP-S3-HE的2.7倍，表明TATm的引入，有效提高了S3-HE的细胞穿膜能力，可用于将抗肿瘤药物靶向运输到肿瘤细胞内发挥药理效应。 为了验证该肿瘤靶向穿膜肽在抗肿瘤药物胞内靶向运输方面的应用，本课题将S3-HE-TATm与来源于苦瓜的一种抗肿瘤蛋白MAP30的基因融合，将重组表达并纯化的融合蛋白与体外培养的肿瘤细胞株或正常细胞株共孵育，观察其细胞生长抑制活性。结果表明，S3-HE-TATm显著提升了MAP30重组蛋白对所有测试的肿瘤细胞抑制增长效率，其中对肿瘤细胞B16抑制活性显著提高，与没有融合该靶向穿膜肽的重组蛋白相比，抑制活性提高了17倍;而对于正常细胞株MRC-5，融合有靶向穿膜肽的重组蛋白的细胞毒性仍能保持在较低水平。这表明S3-HE-TATm具有特异性识别肿瘤细胞的功能，是又一种性能优良的新型肿瘤药物靶向运输载体，可用于肿瘤治疗的进一步研究。 因此，本课题通过对原有S3-HBD肿瘤靶向肽进行改造，引入来源于HB-EGF的HE，获得了肿瘤靶向性能更佳的新型肿瘤靶向肽S3-HE;通过进一步引入温和型细胞穿膜肽TATm，得到穿膜效率更高的药物靶向运输载体S3-HE-TATm。这种新型靶向穿膜肽与MAP30的融合蛋白具有更高肿瘤细胞专一性杀伤能力的结果表明，该肿瘤靶向穿膜肽可成为新型药物体内靶向运输载体，用于各种肿瘤疾病的治疗。