天然的大肠杆菌中,葡萄糖主要通过糖酵解途径(Embden-Meyerhof-Parnas Pathway,EMP)进行代谢。但是在丙酮酸到乙酰辅酶A的代谢过程中,会出现1/3的碳损失。为了减少葡萄糖在代谢过程中的损失,增强菌体的产物转化效率,我们构建了 EP-bifido途径。EP-bifido已经在聚羟基脂肪酸酯、甲羟戊酸(MVA)等产物的发酵中经取得较好的实验结果,但由于能量和还原力平衡未达到最优状态,因此我们利用合成生物学方法动态调节EMP的代谢通量,对EP-bifido途径进行优化。本论文中,我们通过两方面的改造增强MVA的产量及产率。一方面我们替换了磷酸戊糖途径(Pentose phosphate pathway,PPP)第一个基因zwf(编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶)的启动子以增强PPP的代谢流,增大NADPH的供应能力。除了从IGEM(www.igem.org)中挑选五个不同强度的启动子之外,我们利用了宿主菌Bw25113 △pfkA的糖磷酸压力现象,克隆并使用SgrR-SgrS操纵子中的启动子,通过菌体自身糖磷酸压力的调节机制,动态调整PPP的通量。最终改造菌与野生型菌株相比,NADPH、NADH以及ATP的合成情况与贡献比率均有较明显的差异。其中,改造菌株BP10BF菌株发酵培养72h后,可以积累11.2g/L的MVA,摩尔转化率达到62.2%。在此基础上,我们通过改变MVA生产途径表达强度进一步提高了转化率,使用BBa-J23102启动子过表达甲羟戊酸生产途径后,BPB02F菌株MVA产量达到11.14g/L,转化率达到68.4%。另一方面,为了避免pfkA基因敲除带来的代谢紊乱及生长抑制,我们引入了 CRISPRi(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference)系统对pfkA的表达强度进行抑制。我们设计了三个有效的CRISPRi抑制靶位点,并进行了组合发酵尝试。从发酵结果中我们发现,CRISPRi系统的引入对菌体生长产生了一定程度的抑制,但是该系统确实对提高产物转化率有一定效果。菌株BiB1F的MVA产量为8.53g/L,转化率达到了 68.7%。考虑到外源添加诱导剂的微毒性及操作复杂性,我们利用转录因子分解代谢阻遏/激活蛋白Cra的代谢调控功能,更改pfkA的启动子序列,使pfkA的表达受到Cra的调控下调启动子,从而实现自诱导抑制。在Cra调控pfkA的发酵实验显示,pfkA启动子更换为Cra调控启动子后,菌体的理化特性产生了非常大的变化。部分改造菌株生长上限明显提高,同时所有的菌株都出现了快速耗糖的能力增强,耗糖最多的BMB02F在发酵72h时糖耗达到了 102.5g。菌体的MVA生产和积累能力也实现了前所未有的提高,其中菌株BMBF 72h发酵生产MVA产量达52.66g/L,转化率达64.96%,菌株BRBF 72h发酵生产MVA产量达55.31g/L,转化率达63.00%。经过我们优化后的EP-bifido途径,利用该系统的工程菌经摇瓶发酵的MVA产量最高可以达到55.31g/L。利用Cra调控启动子调节了pfkA的表达,使得菌体既积累了足够的生物量,又适时地将大量通量引入PP途径,真正做到了将生长和生产分开,兼顾了产量与产率。目前该产量是已报道的MVA摇瓶发酵的最高产量。