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背景钙粘蛋白(Cadherins)是一类钙离子依赖型的跨膜糖蛋白,主要功能是介导细胞与细胞间的粘附。在神经系统形成和发育过程中神经元可能通过同种分子粘附连接在一起形成核团,所发出的神经突起向同种粘附分子阳性部位投射,从而形成复杂的神经回路。Cadherin家族成员众多,Cadherin6B(Cdh6B)作为细胞粘附分子在神经系统中介导细胞粘附,影响神经细胞的分选、迁移和定位及轴突生长和路径选择。研究Cdh6B的功能,有助于更全面的了解钙粘蛋白家族各成员之间的功能联系,能更好的研究神经系统发育机制。目的在建立鸡胚活体电转技术和脊髓Open-book技术基础之上,在鸡胚发育过程中实现Cdh6B在脊髓中的超表达和抑制表达,进一步分析其对脊髓神经元生长、迁移及轴突定位的影响。方法1.培养HEK293T细胞,脂质体转染HEK293T细胞,实验分四组:空白对照组只转染pCAGGS-GFP,超表达组转染Cdh6B超表达质粒,抑制组1转染Cdh6B抑制1+Cdh6B超表达,抑制组2转染Cdh6B抑制2+Cdh6B超表达。转染后做免疫荧光和western blot验证异常表达质粒。2.活体原位电转:鸡胚正常培养到2.5d～3d(E2.5～E3)时,将目的基因Cdh6B的超表达质粒和抑制表达质粒分别导入鸡胚脊髓髓腔。转染后24h,48h,72h分别取材,4%多聚甲醛固定过夜、18%蔗糖脱水4h后包埋,冰冻切片,通过免疫荧光和原位杂交技术检测Cdh6B表达变化。3.活体原位电转:鸡胚正常培养到2.5d～3d(E2.5～E3)时,将目的基因Cdh6B的超表达质粒和抑制表达质粒分别导入鸡胚脊髓髓腔。转染后第六天取出胚胎,用Open-book技术取出完整脊髓平铺于载玻片,4%多聚甲醛固定1.5h后DAPI染色30min,加盖盖玻片,荧光显微镜下观察神经纤维投射情况。结果1.Cdh6B的超表达载体pCAGGS-Cdh6B转染HEK293T细胞后,细胞免疫荧光和western blot结果表明pCAGGS-Cdh6B质粒能够实现Cdh6B的超表达;同时由公司构建的两个抑制质粒pGPU/GFP/Neo-Cdh6B-shRNA1和shRNA2用同样的方法检测,表明 pGPU/GFP/Neo-Cdh6B-shRNA1 具有较好的抑制效果,而 pGPU/GFP/Neo-Cdh6B-shRNA2抑制效果较差。因此,后续实验中以Cdh6B-shRNA1作为抑制载体。2.通过对各种转染条件的摸索,成功建立了鸡胚脊髓电转基因方法。获得的适用于CUY-21型多功能活体电转化仪的电转条件为:发育2.5d的鸡胚,电转前滴加37°C预热的含有抗生素的生理盐水,电转电压18V,每次电击持续60mA,间隔100ms,电脉冲6次。转染pCAGGS-GFP质粒24h后鸡胚成活率80%,存活胚胎GFP阳性表达率为85.7%,将GFP阳性表达胚胎的脊髓做切片,检测到仅在脊髓一侧有GFP阳性细胞,说明采用该电转技术能实现外源基因在鸡胚脊髓中的表达。3.超表达质粒和抑制质粒转染鸡胚脊髓,冰冻切片后,免疫荧光、原位杂交技术检测表明,成功建立了 Cdh6B在鸡胚脊髓的超表达,但由于内源性Cdh6B表达位置的特殊性,未能成功建立抑制表达。4.活体原位电转发育2.5d～3d(E2.5～E3)鸡胚,实验分三组。空白对照组只转染pCAGGS-GFP,超表达组,抑制组。发育第六天取出整个脊髓,展开平铺,DAPI染核后荧光显微镜下观察,超表达组神经纤维投射到对侧增多而抑制组神经纤维投射受到抑制,无法穿越底板投射到对侧。结论在鸡胚脊髓中异常表达Cdh6B,对脊髓神经纤维的投射有非常重要的影响,说明Cdh6B参与脊髓神经元轴突的生长与路径选择。