苏丹草抗旱基因资源挖掘、分子标记开发及应用

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苏丹草(Sorghum sudanense(Piper)Stapf.)为禾本科高粱属一年生草本植物,具有分蘖力强、再生性好、营养价值高和适口性好等优点,可多次刈割作青饲或青贮,也可用于调制干草,是许多国家畜牧业发展的重要饲料作物,也是我国南方地区“粮改饲”种植模式的优选牧草之一。但是干旱作为主要的逆境因子之一,严重影响了苏丹草种子萌发与苗期建苗,从而影响苏丹草后期的生长发育、产量和品质。本研究从苏丹草幼苗对干旱胁迫的响应入手,从生理响应层面全面评价10份材料的抗旱性,筛选出抗旱性较强的‘乌拉特1号’和S1苏丹草,并以‘乌拉特1号’为材料进行RNA-Seq测序。经过序列比对,差异基因分析,筛选出了5个抗旱候选基因,并将Sb BAM1基因进行拟南芥转化分析,得到3株阳性转基因植株。并开发出54个SSR分子标记引物,揭示了苏丹草和高丹草等材料丰富的遗传多样性,利用S1苏丹草与高粱不育系杂交,育成抗旱性好,产草量高,生长速度快,品质好的国审品种“蜀草1号”。本研究主要结果如下:1.采用沙培植物育苗法,以聚乙二醇6000(PEG-6000)模拟干旱胁迫,研究7份苏丹草及3份高丹草幼苗期对干旱胁迫的生理响应,并利用隶属函数法对其抗旱性进行综合比较分析,以期为高粱属作物抗旱新品种的选育和优质牧草栽培提供依据。结果表明,抗旱性强的种质材料在干旱胁迫下抗氧化能力强、叶绿素持有率高、维持较高的光合性能和细胞膜结构完整性。依据利用11项抗性生理相关指标(叶片相对含水量(RWC)、相对电导率(EL)、丙二醛含量(MDA)、叶绿素含量、叶绿素荧光(Fv/Fm)、净光合速率、水分利用效率及抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT和APX))对10份材料的抗旱隶属值进行计算,其综合抗旱适应性鉴定结果为:材料编号5(CF019623)和7号(CF019634)两份苏丹草及9号(‘蜀草1号’高丹草)抗旱性强,4号(‘乌拉特1号’苏丹草)、8号(‘蜀草2号’高丹草)和10号(‘S1’苏丹草)较强,6号(CF019626)高丹草抗旱性最弱;在苏丹草材料内按照抗旱性由强到弱排序:CF019634>CF019623>‘乌拉特1号’>‘S1’>CF019621>CF005161>‘盐池’。2.采用新一代测序技术(RNA-Seq)对‘乌拉特1号’(Wulate No.1)苏丹草品种的干旱差异表达基因进行鉴别。本次测序总共获得852,543,826个raw reads,筛选后得到816,854,366个clean reads,经过序列拼接获得80,686个unigene,其中45,065个(55.9%)unigenes被确认为编码序列(CDSs);经Gene Ontology分析有31,444个unigenes得到注释,经同源蛋白(KOG)聚类分析,将11,778个unigenes归为25类,11,223个unigenes注释到280个KEGG通路中;经过q RT-PCR验证发现,5个差异表达基因与PEG胁迫显著相关,且这5个未知功能的基因均在干旱胁迫下上调表达。研究结果可用于转基因育种、分子标记开发以及分子标记辅助育种等工作。3.基于高通量测序结果开发苏丹草EST-SSR标记,并对34份苏丹草和2份高丹草种质资源进行遗传多样性分析,验证所开发的EST-SSR引物可应用性。从苏丹草转录组的80,686条序列中鉴定出17,548个SSR位点分布在13,574条序列中,分布频率为16.82%。一、二和三核苷酸重复分别占38.59%、19.18%和39.09%,SSR重复基元的重复次数分布在5~23次之间;开发的300对引物扩增成功率达73.67%,其中有54对引物为多态性引物,并从36份材料中一共扩增得到275个条带,其中多态性条带有205条,多态位点百分率(PPB)为73.05%,多态信息含量(PIC)平均值为0.41,遗传距离的变化范围为0.3922~0.9020;聚类分析结果将36份供试材料分为3大类群,相同品种的材料聚为一类,材料间的聚类与地理来源呈相关性。以上结果证明了利用苏丹草转录组数据开发SSR标记的可行性并揭示了供试材料间具有丰富的遗传多样性,为苏丹草及近源物种种质资源的多样性水平和变异分析以及分子标记辅助育种等研究提供依据。4.本研究在转录组测序和差异基因筛选的基础上,从苏丹草中克隆出了一个淀粉酶(BAM)类基因的序列,命名为Sb BAM1。该基因具有一个1641 bp的开放阅读框,编码547个氨基酸,合成的蛋白质分子量为59.58 k Da,理论等电点(p I)为7.96。通过构建植物超表达载体p CAMBIA1300-Sb BAM1,采用农杆菌介导法侵染拟南芥花序,利用潮霉素筛选和PCR检测获得3株阳性植株,表明目的基因已成功导入拟南芥基因组中。本研究为进一步探索Sb BAM1基因在苏丹草抗旱性调控中的作用奠定了基础。5.利用抗旱性较强的S1苏丹草(材料编号为10号)与不同高粱不育系进行杂交组合,通过测定其配合力获得杂交最优组合“72A*S1”高丹草,并申请参加国家区域试验。区试结果显示:“72A*S1”高丹草在全国九个点表现出很好的适应性,尤其是在最佳适应区域表现出抗旱性好、产草量高等特点。“72A*S1”高丹草在2016年较对照增产14.36%~18.48%,2017年较对照增产12.27%~18.36%,且生长速度快、品质好。与对照相比较,“72A*S1”高丹草粗蛋白提高15.6%~30.6%,酸性洗涤木质素含量降低23.08%~33.33%,并于2018年通过国家草品种审定委员会审定,命名为:‘蜀草1号’高丹草新品种,适宜于我国长江流域推广应用。
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