抗安丝菌素单抗的制备及其ELISA检测方法的建立

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抗体药物偶联物(Antibody-drug conjugate)是一类正在进行临床研究的、用于治疗癌症的日益重要的新型的靶向性药物。在开发这类药物的过程中,在研究药物在体内体外的稳定性、药物在体内代谢的情况时,我们需要精确的测定小分子药物从抗体上脱落的比例、偶联上的小分子和抗体的摩尔比值变化、血液中脱落的小分子药物的浓度。ELISA(酶联免疫分析法enzyme-linked immunosorbent assay)检测方法相对同位素标记法、LC-MS等检测方法具有经济、快速、便捷等优势,而小分子药物人工抗原和抗体的研制是建立酶联免疫快速检测的关键。鉴于此,本论文开展了以下研究:设计合成了2种安丝菌素(Ansamitocin)衍生物DM1抗原,一种免疫抗原KLH-MCC-DM1,一种包被抗原trastuzumab-2A-DM1;通过测定抗体偶联前后在波长252nm吸光值的变化,测定DM1偶联到载体蛋白的情况。结果表明二种偶联方式都成功将DM1偶联到载体蛋白。将制备的免疫抗原免疫BALB/C小鼠以制备抗DM1单克隆抗体,经过多轮ELISA筛选,获得1株可稳定分泌抗DM1单克隆抗体的母克隆,经过三轮亚克隆,获得稳定的杂交瘤细胞。制备腹水并进行了免疫特性分析。结果表明该杂交瘤细胞株分泌的抗体亚类为IgG1,轻链为lambda型。利用获得的单克隆抗体建立了DM1和抗体的ELISA检测方法。ELISA检测方法学验证结果表明Trastuzumab-2A-DM1抗体部分的检测不受bFGF、EGF、VEGF、TNF-α的干扰;高、中、低三个浓度样品的平均回收率在85~95%之间,精密度小于10%;定量下限1.95ng/ml的准确度为93.95%,精密度为5.5%;板内和板间的准确度都在80~100%范围内,精密度<15%。最后测定了trastuzumab-2A-DM1在大鼠体内的代谢。
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