一、背景与目的有毒中药的毒性和有效性均可反映为有毒中药的药代动力学特征。从药代动力学的角度,认识有毒中药的毒性特点,并从药物代谢等影响药代动力学特征的关键环节和分子靶点认识有毒中药的安全性和有效性,可为临床合理驾驭有毒中药的毒性提供依据。基于此,本论文主要选择了山豆根有效成分及附子、细辛共同的有效成分为主要研究对象,从药代动力学和代谢关键环节上开展研究工作。山豆根是越南槐(Sophora tonkinensis)的干燥根茎,主要分布在中国的西南部,临床作为一种常用中药用于治疗黄疸,炎症,肿痛。氧化苦参碱(oxymatrine, OMT)与苦参碱(matrine, MT)是山豆根中最主要的有效成分,也是有毒成分,是研究山豆根的代表性化合物,它们具有抗炎,抗肿瘤,抗乙肝病毒的作用。山豆根提取物具有良好的药理活性,同时也具有一定的副作用与肝脏毒性。研究报道关于氧化苦参碱与苦参碱的治疗作用与潜在毒性的讨论较多。科学研究已经证实,氧化苦参碱与苦参碱均是主要的毒性生物碱,其中苦参碱主要有神经毒性的作用。而氧化苦参碱向苦参碱的转化是造成血中氧化苦参碱浓度低与苦参碱浓度高的主要原因,这种转换可以影响氧化苦参碱与苦参碱的疗效与毒性,目前这种转化的机制尚无文献报道。因此,本论文以oxymatrine与]matrine为目标化合物,研究对比了山豆根提取物与氧化苦参碱纯品药代动力学特征,及氧化苦参碱生物转化的机理。附子、细辛中的主要有效成分之一去甲乌药碱(Higenamine),具有强心与抗炎的作用,在我国去甲乌药碱现在已经进入Ⅱ期临床研究。但其安全性评价仍然存在巨大挑战。其中可直接影响去甲乌药碱药动学特征与药效作用的代谢特征缺失。文献报道,新西兰兔静脉给药去甲乌药碱后在尿液中可检测到主要有24-33%的去甲乌药碱葡萄糖醛酸化结合物,这可能是导致其低生物利用度的原因。因此,我们重点研究了去甲乌药碱的葡萄糖醛酸化代谢。因此,本文的研究目的是(1)以氧化苦参碱与苦参碱为特征性标志物,比较了单独给药氧化苦参碱单体与单独给药山豆根提取物的药动学特征差异,为山豆根的毒性预警和临床应用提供依据；(2)我们猜测造成山豆根提取物与氧化苦参碱单品药动学差异的原因是由于氧化苦参碱在体内向苦参碱的转化,因此进一步研究氧化苦参碱向苦参碱转化的代谢特征与机理；(3)为探寻去甲乌药碱低生物利用度的原因及代谢种属差异对药动学的影响,我们基于药物代谢酶研究去甲乌药碱的葡萄糖醛酸化代谢特征与代谢机理,为临床前研究及临床安全用药提供基本的理论基础。二、方法建立灵敏的UPLC-MS/MS检测方法,检测口服给药山豆根提取物与口服,静脉给药氧化苦参碱纯品大鼠血浆中OMT与MT的浓度,运用winnolin3.3进行数据模拟处理得到药动学参数。运用重组人源化CYP亚酶与化学抑制剂在无氧条件下进行体外微粒体孵育模型及高效液相色谱技术,进行氧化苦参碱代谢机理研究。采用重组人源化UGT亚酶与不同种属的肝微粒体进行体外孵育实验,研究去甲乌药碱的UGT代谢机理。统计学处理：数据用mean±SD来表示。统计软件SPSS13.0.采用统计方法independent-samples T-test或者One-way ANOVA进行数据分析。三、结果1.山豆根提取物中苦参碱(matrine)与氧化苦参碱(oxymatrine)的含量测定建立一种灵敏,可靠的HPLC方法测定山豆根提取物中的氧化苦参碱与苦参碱的含量,为确定药动学研究中的给药剂量提供依据。受试样品山豆根提取物中氧化苦参碱的含量为0.60%,苦参碱的含量为0.40%。2.大鼠口服山豆根提取物和OMT单体的药动学特征参数及生物利用度评价建立一种灵敏,可靠,快速的UPLC-MS/MS方法来检测大鼠血浆中的氧化苦参碱与苦参碱的血药浓度。大鼠灌胃或尾静脉给药后,采用后眼眶取血的方法分别完成大鼠口服给药山豆根提取物,口服与静脉给药氧化苦参碱单体的药代动力学实验。研究发现,大鼠口服氧化苦参碱单体2mg/kg与山豆根提取物(相当于氧化苦参碱2mg/kg,苦参碱1.3mg/kg)后,表现为不同的药动学行为,Cmax,AUC0→t,以及MRT0→t均有显著性差异(t-test, p<0.05)。大鼠口服山豆根提取物与口服氧化苦参碱单体后,血中可发现大量的苦参碱,氧化苦参碱的绝对生物利用度分别为1.87%,6.79%,均较低。我们将代谢产物苦参碱计入后,计算得到大鼠口服氧化苦参碱单体后,总生物碱(MT+OMT)的生物利用度为81.14±8.83%；口服山豆根提取物后,总生物碱(MT+OMT)的生物利用度为69.36士17.37%。3.OMT与MT血浆蛋白结合率实验我们采用操作简便,干扰小,省时高效的超滤法,来研究氧化苦参碱,苦参碱在大鼠血浆中的结合率。实验测得,氧化苦参碱的血浆蛋白结合率为4.80%-8.95%,苦参碱的血浆蛋白结合率为5.10-10.55%,这与之前的药动学实验中氧化苦参碱与苦参碱的快速消除相一致(静脉给药氧化苦参碱与苦参碱的半衰期分别为181.74士31.51min,249.20士76.21min)。4.OMT在人的肝脏与肠道微粒体中代谢生成MT的速率比较分别运用人的肝脏与肠道微粒体,进行体外孵育实验研究OMT在肝脏与肠道中代谢生成MT的酶动学特征,比较OMT在肠道与肝脏中的代谢速率差异。结果表明,OMT在肝脏中的速率与清除率均大于在肠道中(Vm肝脏1.49士0.24nmol/min/mg>Vm肠道0.46±0.05nmol/min/mg,CL肝脏0.0067ml/min/mg>CL肠道0.0031ml/min/mg)。5.CYP亚酶特异性化学抑制剂对OMT代谢生成MT的影响选用一系列CYP亚酶特异性化学抑制剂来(CYP1A2抑制剂马来酸氧氟沙明,CYP2C8抑制剂槲皮素,CYP2C9抑制剂盐酸胺碘酮,CYP2C19抑制剂奥美拉唑,CYP2D6抑制剂奎尼丁,CYP3A抑制剂酮康唑,CYP2E1抑制剂二乙基二硫代氨基甲酸)研究负责参与OMT代谢生成MT的CYP酶亚型。结果表明,与对照组相比,加入CYP3A,2C19组的MT生成量均减少(p<0.05,one way ANOVA),其中CYP3A组相对于对照组减少了50%以上,说明CYP3A主要参与了其代谢过程。6.人源重组化CYP亚酶纯酶实验选用人源重组化CYP纯酶验证参与OMT代谢生成MT的CYP酶亚型。结果表明,CYP3A4组的MT生产量显著高于其他组(CYP1A2,1B1,2D6,2C19,3A5,2C8,2B6,2A6,1A1.2E1),说明CYP3A4主要负责OMT代谢生成MT。7.去甲乌药碱(Higenamine)的UGT代谢机理研究我们运用12种重组人源化UGT亚酶与Higenamine在高、中、低三个浓度(20μM,40μM,200μM)下进行孵育,分别考察它们在不同的人UGT同工酶中的代谢速率的差异。研究表明,UGT1A6,UGT1A8, UGT1A9参与去甲乌药碱的代谢,代谢速率大小顺序为：UGT1A9>UGT1A8> UGTIA6。UGT1A8最主要存在于人的肠道中,UGT1A6最主要存在于人的肝脏中,UGT1A9则几乎只在肝脏中表达,即我们推测去甲乌药碱的代谢器官主要是在肝脏和肠道。与此同时,运用重组人源化UGT亚酶,研究去甲乌药碱在主要负责其葡萄糖醛酸化代谢UGT亚酶中的酶代动力学特征。去甲乌药碱在UGT1A9中的代谢属于非经典米氏方程中的自身激活型(Autoactivation),在UGT1A8中的代谢属于经典的米氏方程(Michaelis-Menten equation)。清除率Vmax/Km的大小是UGT1A9(0.0055ml/min/mg)>UGT1A8(0.0005ml/min/mg)。8.UGT亚酶化学抑制剂对去甲乌药碱(Higenamine)代谢影响的研究为进一步验证参与去甲乌药碱代谢的UGT酶亚型,我们考察了UGT特异性化学抑制剂：UGT1A6特异性化学抑制剂苯基丁氮酮(phenylbutazone), UGT1A9特异性化学抑制剂香芹酚(carvacrol)对去甲乌药碱在人的肝脏中的葡萄糖醛酸化反应的影响。结果表明,与对照组相比,加入carvacrol的UGT1A9与Human Liver Microsome (HLM)反应体系中代谢产物的生产量随着抑制剂浓度的增加而降低(p<0.05, one way ANOVA),而加入phenylbutazone组则没有该趋势。说明UGT1A9是去甲乌药碱在肝脏代谢的最主要亚酶,UGT1A6则不是。9.比较去甲乌药碱在肝脏与肠道微粒体中的酶代动力学特征的研究运用肝脏与肠道的微粒体,进行体外孵育实验,研究Higenamine在肝脏与肠道中的酶动学特征,比较Higenamine在肠道与肝脏中的代谢速率差异。结果表明,Higenamine在肝脏中的反应速率(6.81±1.73nmol/min/mg)要大于肠道(1.26±0.30nmol/min/mg)。10.去甲乌药碱在大鼠,小鼠,豚鼠,狗,人的肝微粒体中代谢速率差异的比较及酶动学特征研究根据文献报道,去甲乌药碱在兔,狗,人的药代动力学特征差异较大,我们猜测这可能是由于它的代谢差异造成的。为验证此假说,我们运用五种不同种属(大鼠,小鼠,豚鼠,狗,人)不同性别的肝微粒体研究Higenamine的葡萄糖醛酸化代谢速率与酶动学特征的差异。结果表明,Higenamine在五种不同种属的肝微粒体中的代谢速率与酶动学特征均存在显著性差异。Higenamine在雄性与雌性大鼠,小鼠的肝微粒体中的葡萄糖醛酸化代谢反应为底物抑制型(Substration inhibition);在雌性及雄性的豚鼠,狗,人的肝微粒体中的代谢属于自身激活型(Autoactivation)。狗与人的葡萄糖醛酸化的酶代动力学特征最为接近,提示我们在今后模拟人体代谢的研究中可选用狗为实验动物。与此同时,我们研究了性别差异对去甲乌药碱葡萄糖醛酸化代谢的影响。结果表明,除了大鼠存在显著性的性别差异及狗在中浓度和高浓度存在显著性差异外,豚鼠,小鼠,人的去甲乌药碱葡萄糖醛酸化代谢无明显性别差异。四、结论1.大鼠口服氧化苦参碱单体2mg/kg与山豆根提取物(相当于氧化苦参碱2mg/kg,苦参碱1.3mg/kg)后,在血中发现均以苦参碱存在形式为主,且表现为不同的药动学行为,Cmax,AUC0→t,以及MRT0→t均有显著性差异(t-test, p<0.05);氧化苦参碱的绝对生物利用度分别为1.87%,6.79%,均较低,我们猜测造成这两种生物利用度差异的原因可能是山豆根中的其他成分可能影响氧化苦参碱向苦参碱的转化过程；为阐明药动学差异的原因,进一步探寻该转化机理,发现OMT发生转化的器官在肝脏,OMT发生Ⅰ相还原反应生成MT,且反应主要由CYP3A4介导,这一转化过程直接影响了山豆根主要成分的生物利用度及其药动学特征。2. UGT1A6,UGT1A8,UGT1A9参与了去甲乌药碱的葡萄糖醛酸化代谢,推测它的主要代谢器官为肝脏,并且在肝脏中主要是由UGT1A9代谢；去甲乌药碱在五种不同种属的肝微粒体中表现为不同的酶代动力学特征,这可能是导致去甲乌药碱在不同种属动物体内的药动学特征不同的原因；狗与人的葡萄糖醛酸化的酶代动力学特征最为接近,提示我们在今后模拟人体代谢的研究中可选用狗为实验动物。