关于肠道细菌的生理学研究由于缺乏简便、高效的标记及成像方法而难以深入。为了解决这些问题,本文发展了基于非天然氨基酸探针的肠道菌群标记与成像新方法。非天然氨基酸代谢标记探针具有高强度、高标记效率等优势,其中D-型氨基酸代谢标记探针还具有高标记覆盖率的特点,为肠道菌群整体标记提供了可能。此外,近红外二区（second near-infrared window,NIR-Ⅱ）有机荧光小分子及组织透明化方法的发展提高了成像组织穿透性及空间分辨率,有力推动了某些复杂体系的成像研究。基于此,本论文主要开发了以下肠道菌群成像新方法:（1）D-型氨基酸代谢标记探针结合NIR-Ⅱ有机荧光小分子活体实时成像肠道菌群。本论文利用D-型炔丙基甘氨酸（DPG）代谢标记探针结合NIR-Ⅱ有机荧光小分子实时活体成像植入小鼠肠道内的肠道菌群或单菌,并进一步探究胃肠蠕动对肠道菌群分布的影响。DPG探针灌胃原位标记小鼠肠道菌群或体外标记单菌后,通过体外生物正交反应将带有叠氮的NIR-Ⅱ荧光基团结合到细菌表面,最后将肠道菌群或单菌植入到受体小鼠内进行实时活体成像观察。DPG代谢标记结合NIR-Ⅱ染料首次实现了肠道菌群及单菌的实时活体成像,具有操作简便、组织穿透性强及空间分辨率高等优势。此外,利用本成像策略还发现了在不同胃肠蠕动速度下肠道菌群的分布明显不同,有望为深入探究胃肠蠕动与肠道菌群的关系提供帮助。（2）D-型氨基酸代谢标记探针结合组织透明化技术三维原位成像肠道菌群。本论文利用带有荧光基团的D-型氨基酸（Fluorescent D-aminoacid,FDAA）代谢标记探针结合CUBIC组织透明化技术对植入小鼠肠道内的肠道菌群或单菌以及小鼠肠道内固有菌群进行三维成像观察,并定量探究了健康及患病小鼠肠道内肠道细菌之间以及肠道菌群与宿主间的空间分布关系。FDAA探针灌胃原位标记小鼠肠道菌群或体外标记单菌后植入受体小鼠肠道内,利用CUBIC技术除去肠道内的脂类物质并对不同肠段内的肠道细菌进行三维成像。通过腹腔注射FDAA探针的方式原位标记小鼠肠道固有菌群,肠道组织经CUBIC技术处理后成像观察小鼠固有肠道菌群的三维分布情况。FDAA代谢标记结合CUBIC组织透明化技术实现了植入细菌的三维原位成像,具有高成像深度及高空间分辨率等优势。本工作创新性地采用腹腔注射FDAA探针代谢标记肠道菌群的方式实现了宿主组织低吸附的肠道菌群原位标记,能够对固有肠道菌群进行原位三维成像。此外,利用FDAA代谢标记结合CUBIC组织透明化技术定量证明了肠炎小鼠小肠段可能存在细菌过度生长的现象,为深入探究肠道菌群的生物地理学信息提供了新思路。为了解决肠道细菌特异性标记的问题,本论文开发了基于L-型氨基酸荧光探针（FLAA）选择性标记特定种类肠道细菌的新方法。FLAA原位代谢标记小鼠肠道菌群,利用流式细胞分选、DNA测序等方法分离鉴定出FLAA探针能够选择性标记肠道菌群中的毛螺菌科细菌。FLAA及FDAA共定位实验证明FLAA的标记靶标为细菌肽聚糖结构。实验表明该标记方法能够高选择性的标记肠道菌群中的某些细菌,为深入研究该类细菌的肽聚糖合成过程及相关生理学问题提供了新方法。本论文基于非天然氨基酸代谢标记策略建立了肠道菌群成像方法,包括实时活体成像方法及固有肠道菌群三维原位成像方法。实现了肠道菌群高标记覆盖率、高特异性、高组织穿透深度、高空间分辨率的成像研究。同时开创性的发展了对某些肠道细菌具有高标记选择性的非天然氨基酸代谢标记策略。利用这些方法有望深入探究肠道细菌之间、肠道菌群与宿主之间的相互作用及相关生物地理学问题,同时为深入研究某些细菌的生理学问题提供有力帮助。