原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是一种世界范围内常见的恶性肿瘤，HCC的死亡率在所有恶性肿瘤中居第三位，以东亚和南非地区的发病率最高。全球每年新增约60万HCC患者，其中有一半发生在中国。HCC的发生是一个多步骤渐进的过程，通常和肝炎病毒感染、酗酒以及肝硬化紧密相关。尽管针对HCC的治疗取得了巨大的进步，但是HCC发生术后复发、转移的比例依然很高。肝癌的发生和转移主要是由肿瘤细胞的恶性增殖和迁移所导致。为了寻找更有效的防治手段，人们对可能导致HCC发生及肿瘤细胞恶性增殖和迁移相关的基因和蛋白进行了广泛研究，发现包括Wnt/β-catenin，p53，Rb和Ras/MAPK在内的一系列基因和信号通路参与了HCC的发生发展。探索HCC的侵袭转移机制、寻找新的诊断标记物和治疗靶点是提高治疗效果的关键。microRNA (miRNA)是近年来发现的一类非编码单链小RNA分子，被认为是基因表达调控领域的重大突破。它们在不同物种间具有较高的保守性，自1993年，在线虫中发现第一个miRNA以来，相继在烟草，果蝇，斑马鱼，小鼠及人类中发现了大量的miRNA。miRNA在细胞内会以较长的前体形式被转录，依次被Drosha-DGCR8、Dicer剪切后形成22bp左右的成熟体形式，在RNA-induced silencing complex (RISC)的帮助下，结合到靶基因的3’非翻译区，降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因的翻译最终导致靶基因的沉默，是细胞内广泛存在的一种精细调节蛋白表达的转录后调控机制。更为重要的是，由于它和靶基因是以不完全匹配的方式结合，因此一个miRNA可以作用于多个靶基因，生物体内至少有30%的基因受到miRNA的调控。研究证实miRNA已经广泛参与到包括癌症、神经系统疾病、免疫系统以及心血管系统疾病在内的多种重大人类疾病的发生以及细胞凋亡，增殖，分化以及迁移等重要的细胞生理过程中。大量的研究结果表明miRNA和肿瘤细胞的增殖、迁移以及HCC的发生有着密切的关系。分析HCC小动物模型，以及临床HCC组织样品相对于正常肝脏组织的miRNA表达谱的变化，发现一些miRNA的表达在HCC中受到抑制，另一些miRNA表达量则增高，如miR-224，miR-21，miR-222，miR-18在HCC中表达上调，而miR-112a，miR-375，miR-195表达受到抑制。本实验通过miRNA表达谱芯片筛选HCC组织及其对应癌旁组织中发生差异表达的miRNA分子，运用多种研究方法，探讨miR-210及其靶基因SIN3A在HCC发生发展及侵袭转移中的相关功能机制，为HCC的诊疗寻找新的靶点。一、原发性肝细胞癌/癌旁组织中差异表达的miRNAs的筛选和鉴定本实验选用高通量的Agilent human miRNA检测6对重复HCC组织/癌旁组织样本，发现HCC组织中miR-210、miR-10b、miR-1181、miR-1246、miR-1290，miR-130b、miR-134等26个miRNA的表达水平与癌旁组织相比显著上调（Foldchange>2,P<0.05），miR-144、miR-145、miR-146a、miR-150、miR-194等39个miRNA显著下调（Foldchange <0.5, P<0.05）。为验证芯片筛选结果，实验中还用茎环法实时定量PCR实验对芯片筛选到的差异表达的miRNAs进行验证。验证结果表明miR-21、miR-222在HCC中高表达，miR-99a在HCC中低表达，这与芯片筛选结果相一致，表明芯片筛选结果是准确可靠的，证实HCC组织和癌旁组织中miRNAs存在表达差异，提示差异表达的miRNAs在HCC的发生发展过程中可能发挥重要作用。通过前期芯片数据筛选及查阅相关文献，我们发现miR-210在乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、泌尿系统及头颈部肿瘤中表达均有明显的升高并和患者的预后相关，而在肝癌中的表达变化及其功能未见报道。此外，miR-210的表达受缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α)所调控，而HCC组织内HIF-1α的表达显著升高，提示HCC中miR-210的表达与HIF-1α信号通路调控有着一定的相关性，我们挑选miR-210作为进一步的研究对象。二、miR-210在原发性肝细胞癌中的表达及功能研究通过定量PCR的方法检测HCC组织、癌旁组织及正常肝组织中的miR-210的表达水平，结果发现与癌旁组织及正常肝组织相比，miR-210在HCC组织中表达明显上调，并且miR-210的表达水平与HCC的进展密切相关，其在慢性肝炎肝组织及肝硬化肝组织中的表达水平显著高于正常肝组织，而在HCC中的表达又明显高于慢性肝炎肝组织及肝硬化肝组织，在巴塞罗那分期B期及C期的HCC病人中，miR-210的表达又显著高于0期及A期的患者，这都说明miR-210的表达水平和HCC的发生及进展密切相关。为了验证miR-210表达水平和患者预后之间的关系，随机挑选120例行手术治疗的HCC患者，完善其病理资料及相关随访信息，检测miR-210在HCC组织中的表达，根据miR-210的表达水平，将120例HCC患者分为两组，比较两组HCC患者的累积无瘤生存率（Disease-free survival, DFS）及总体生存率(Overall survival, OS),结果发现miR-210低表达组患者的DFS及OS均显著高于高表达组患者，对可能影响患者术后复发及生存的各相关因素行单因素及多因素相关分析，发现miR-210的表达水平、AFP的水平、血管侵犯、子灶及肿瘤大小都可作为影响患者术后复发的独立危险因素，而血管侵犯、子灶及肿瘤大小可作为影响患者术后生存的独立危险因素，miR-210的表达水平虽然不能视为影响患者术后生存的独立危险因素，但也部分反映出其对于患者生存的影响（P=0.076），此外，通过比较两组HCC患者的临床病理特征发现，miR-210高表达组患者其合并血管侵犯的比例显著高于低表达组患者，这些结果都表明miR-210的表达与患者预后密切相关，其高表达提示患者预后不佳，肿瘤恶性程度更高，侵袭力更强。为了验证miR-210对于细胞增殖及侵袭能力的影响，我们在人肝细胞HL-7702中过表达miR-210的表达水平，用MTT方法检测细胞增殖能力的变化，发现与对照相比，过表达miR-210之后，细胞的增殖能力明显增强，提示miR-210可以提高细胞的增殖能力，随后transwell实验检测其对于细胞侵袭能力的影响，在人肝癌细胞系SMMC-7721中，过表达miR-210之后，发现与对照相比，过表达miR-210之后细胞的侵袭转移能力明显增强，那么这与临床样本中所发现的miR-210高表达的患者合并血管侵犯、发生肝内转移比率较高的结果相一致。在裸鼠皮下成瘤实验中，我们也观察到了同样的现象，即在人肝细胞系HL-7702及人肝癌细胞系SMMC-7721中分别过表达miR-210之后，发现其成瘤能力与对照相比明显增强。以上这些包括HCC患者临床数据分析的结果都说明miR-210的表达反映了肿瘤的生物学特征，其高表达均提示肿瘤恶性程度高，侵袭能力强。miRNAs通过调控其下游的靶基因参与生命活动及发挥相应的生物学功能，寻找并鉴定miRNAs调控的靶基因才能够揭示其作用机制。为了揭示miR-210在促进HCC发生发展及侵袭转移中的相关机制，我们根据生物信息学的方法，利用相关生物信息统计软件，找到了一个其可能的下游靶基因SIN3A。根据文献报道，SIN3A的表达产物是组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）复合体的成分之一，其可以通过抑制不同的信号传导通路在胚胎发育早期和调节细胞增殖过程中发挥作用。SIN3A是和组蛋白去乙酰化酶活性密切相关的一种大的多蛋白共抑制体的核心成分，在不同的信号传导通路中发挥相应的生物学功能，多种抑癌基因包括p53、pRb、Menin等都可以通过与SIN3A/HDAC复合体的相互作用来抑制它们的靶基因。此外，一些转录因子的改变也导致SIN3A/HDAC复合体的错配，并在急性早幼粒细胞白血病和急性粒细胞白血病的发病中发挥重要作用。SIN3A的缺失可导致与调解细胞周期、线粒体代谢、染色质修饰、DNA修复及凋亡相关基因的功能发生紊乱。由此我们推测SIN3A与多个肿瘤相关基因相互作用并通过不同的信号传导通路在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。我们通过双荧光素酶报告基因系统检测miR-210对于SIN3A的调控作用，结果显示，miR-210可以显著下调含有SIN3A靶基因3’UTR的荧光素酶报告基因pGL3-3’UTR的活性，而对含突变位点的delta-210和miR-210sponge表达质粒对荧光素酶活性无明显改变，表明miR-210对SIN3A3’ UTR有直接负转录调控作用，验证了生物信息学预测的准确性，随后Western Blot结果显示，过表达miR-210可抑制肝癌细胞株BEL-7402和肝癌细胞株SMMC-7721中SIN3A蛋白水平的表达。miR-210能够有效抑制SIN3A表达水平，表明miR-210对其有直接负调控作用，进一步验证了生物信息学及双荧光素酶报告基因系统检测的结果。随后我们在HCC患者的临床样品中，首先通过定量PCR的方法检测SIN3A的表达水平，发现miR-210的表达和SIN3A的表达呈负相关，随后通过免疫组化的方法检测SIN3A在HCC石蜡样品中的表达情况并分析其表达和患者预后的关系，结果发现，组织中SIN3A的表达和miR-210的表达情况呈明显负相关，并且SIN3A高表达的患者其累积无瘤生存率及总体生存率均高于SIN3A低表达患者，这与前面miR-210表达水平与患者预后的关系正好相反，这也间接证实SIN3A确实是miR-210下游的一个靶基因，miR-210通过其发挥相应的生物学功能。上述结果可以表明，miR-210在HCC中起促癌作用，SIN3A是其直接作用的下游靶基因。miR-210通过抑制SIN3A蛋白，增强了细胞的增殖和侵袭能力，并影响患者预后，其有可能成为HCC治疗的新靶点。