在啤酒厂,啤酒腐败菌是指那些对啤酒品质造成危害、破坏啤酒风味及生物稳定性的一类兼性或严格厌氧微生物。而细菌通常是一类革兰氏染色呈阳性、过氧化氢酶旱.阴性的产乳酸菌。啤酒中污染菌是啤酒生产中出现的一种生物污染。目前,啤酒厂对啤酒腐败菌的检测方法是将样品膜过滤后,把膜放在琼脂培养基表面或液体培养基中,在厌氧环境中培养,根据菌株在培养基中生长情况,如生长速度,菌落形态,特殊的生理反应(如特殊底物的显色反应),是否产孢子以及是否出现混浊等来检测样品中的活菌。对啤酒腐败菌的检测至少需花费5-7d,而对林氏乳杆菌的检测则至少需要7d,甚至更长。要解决啤酒腐败菌检测手段远远滞后于生产的矛盾,就必须研究其快速检测技术。准确、快速地检测和鉴定出啤酒中的污染菌不仅能保证啤酒品质,还体现出啤酒企业所具有的高技术水平。随着现代生物技术的发展,污染菌的检测方法也有所提高,目前研究较多的快速检测方法包括ATP检测方法、免疫学的险测方法、分子生物学检测方法等。本实验在前人工作的基础上,利用聚合酶链式反应(PCR)技术快速、灵敏检测啤酒腐败菌的方法,可在数小时内,将靶序列特异性扩增至百万倍以上,达到检测目的。本研究主要内容是利用选择性培养基分离纯化出5种腐败菌,根据细菌形态把它们分别编号为G9181、G9182、G9251、G9252、G9253。通过API50CHL鉴定试剂条把它们分别鉴定为短乳杆菌、短乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌。以鉴定的短乳杆菌、植物乳杆菌、布氏乳杆菌的DNA为模板,根据核糖体DNA(16SrDNA)的高度保守区设计通用引物,使得该引物可以同时扩增出上述三种菌的扩增产物。旨在设计出合理的种特异性通用引物,然后对所设计引物进行扩增条件的优化,最终确定设计出引物的最适扩增条件。以短乳杆菌为实验对象,对其进行预增菌、模板提取、PCR扩增等条件的优化。通过研究,得到了以下结论：1、对啤酒中污染菌进行分离、纯化,通过一系列生理生化反应以及API50CHL试剂条菌种鉴定后,结果显示啤酒中的污染菌为短乳杆菌、植物乳杆菌、布氏乳杆菌。2、预增菌,研究了培养基优化,比较了MRS培养基以及改良的MRS1培养基(将葡萄糖分别换成可溶性淀粉、菊粉)对于菌种培养的影响。结果表明菊粉对乳酸菌生长有一定的促进作用。PCR检测短乳杆菌灵敏度达到18个CFU/mL由于乳酸菌细胞排列为单个、成双和成束,而成束的细胞可高达10个,因此推测PCR检测的灵敏度可达18-180个CFU/mL.当细胞初始浓度为10CFU/mL,经过用MRS1对菌体进行细胞富集培养,增殖所需要的时间为24-30h。加上样品制备、模板提取、PCR扩增及电泳观察所需的时间8h,检测有害菌株总需时32-38h,比传统平板培养法缩短3-5d,大大提高了检测效率3、模板提取,研究了CTAB法、煮沸法、溶菌酶法、蛋白酶K法、溶菌酶及及蛋白酶K混合酶裂解煮沸制备的模板DNA直接电泳和用以PCR扩增的结果。PCR结果同样表明,CTAB法、溶菌酶及蛋白酶K混合酶裂解煮沸法均能得到目的产物片段,但CTAB去相对提取模板时间较长.溶菌酶及蛋白酶K混合酶裂解煮沸法提取效果与CTAB去基本相同,且提取时间较短,因此可选溶菌酶及蛋白酶K混合酶裂解煮沸法提取模板。4、改进的25 u 1 PCR优化体系：Taq酶用量2.0U/ml, Mg2+浓度2.0mmM,退火温度为50。C。扩增程序：94℃4min进入循环,94℃30s,50℃30s,72℃30s,35个循环后,再72℃下延伸5mmin。5、PCR优化后的体系对5株标准菌(短乳杆菌、植物乳杆菌、布氏乳杆菌、奶酪乳杆菌、乳酸乳球菌)与分离到的3株腐败菌(短乳杆菌、植物乳杆菌、布氏乳杆菌)的PCR结果进行了比较。结果显示3株腐败菌(短乳杆菌、植物乳杆菌、布氏乳杆菌)与相应的3株标准菌(短乳杆菌、植物乳杆菌、布氏乳杆菌)均可以扩增出产物。而其它两株标准菌(奶酪乳杆菌、乳酸乳球菌)无扩增结果。