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局部炎症是OA的致病因素,而且局部炎症状态的发生要早于软骨破坏。针对OA炎症的发生机制研究始终停留在组织和细胞群水平,无法高分辨率的探寻炎症环境下的单个细胞状态,以及细胞状态如何改变以致发展为不可逆的软骨退变阶段,进而导致疾病状态。目的:聚焦于OA软骨退变,在单细胞分辨率下研究在白介素IL-1β诱导的炎症环境中体外扩增软骨细胞的异质反应,分析并验证关节周围组织免疫浸润程度及其驱动软骨细胞表型转变的机制,并利用生物信息学方法探究OA进展过程中软骨细胞间通讯态势及该过程中重要转录因子的激活规律。方法:1.体外扩增人来源的关节软骨细胞13天,获得的细胞分别接种于培养板,并用IL-1β处理0、24和48小时。收集处理后的细胞并进行单细胞RNA测序。使用多种生物信息学工具和相关实验来明确单细胞分辨率下软骨细胞功能改变的特征和规律。2.从基因表达综合（GEO）数据库中下载了包含来自12位OA患者和12位非OA患者的半月板组织表达谱的数据集以及随附的临床信息。用Xcell评估免疫浸润程度及其与临床特征之间的相关性,运用WGCNA鉴定免疫相关基因模块。并通过体外分子生物学实验验证并探究关节周围组织免疫浸润程度及其驱动软骨细胞炎症的可能机制。3.使用最近发布的来自OA不同进展时期的人类软骨细胞的sc RNA-seq数据集。通过seurat函数包对该数据重新聚类并按照原文所提示的Mark基因进行了亚群注释。通过Cellchat细胞通讯计算原理进行配体-受体参考数据库比对,构建细胞通讯网络,利用SCENIC方法来映射基因调控网络,用AUCell函数包对每个细胞中转录因子的活性进行评分。结果:单细胞测序分析表明:在初始阶段存在两个具有不同基因表达模式的主要细胞亚群,它们具有与炎症进展时间相吻合但性质不同的表型变化。它们转化为两个终末细胞亚群,分别通过“典型炎症反应”和“非典型炎症反应”两种途径表现出OA促炎表型和单纯增殖表型。该过程中涉及的细胞亚群表现出与OA患者天然软骨细胞类型的内在联系。控制细胞转化为OA表型的基因主要集中在NFκB通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、上调的KRAS信号通路和IL2/STAT5信号通路以及与凋亡和活性氧有关的通路。免疫浸润分析确定了OA与非OA组半月板组织免疫浸润程度的不同,加权基因共表达网络分析（WGCNA）确定了与OA和巨噬细胞密切相关的基因模块。模块中的基因高度富含与免疫反应相关的过程,例如“抗原加工和呈递”、“MHC II类蛋白复合物的多肽抗原组装”、“通过II类MHC进行抗原加工和肽或多糖抗原的呈递”、“T细胞共刺激”、“T细胞受体信号通路”。而KEGG分析显示其通路富集集中在“抗原处理和展示”、“移植物抗宿主病”、“同种异体移植排斥”,“细胞粘附分子”,“吞噬体”和“类风湿性关节炎”涉及的信号通路以及多种自身免疫性疾病相关通路中。WGCNA还揭示了模块中的调节免疫相关相互作用网络的优势基因为NCF1、C1QB、AHR、C1QC、NCF1B、HLA-DRA、TMEM176B、CYBB、ITGAM、PTPRC,其中大多数已知与免疫相互作用和炎症有关。体外实验也同时表明,关节周围组织较强的免疫激活作用和巨噬细胞共培养下异常的软骨反应性活性氧（ROS）水平以及异常的软骨代谢改变。确定了跨不同细胞类型的细胞间通信活动的主要模式,OA的进展过程中早期主导细胞为效应软骨细胞,其接受外部环境影响后,以自分泌和旁分泌形式进行细胞间通讯,激活包括BMP通路和TGFβ通路在内的25条信号通路。而进入晚期OA后,主导细胞演变为肥大软骨细胞前体细胞、肥大软骨细胞和增殖软骨细胞,其中肥大软骨细胞前体细胞、肥大软骨细胞在OA的病理表现中起重要作用。同时,每一个时期中活化的转录因子不尽相同,每一个亚群都具有该亚群独特的活化转录因子,及至末期细胞群体开始显现出明显与OA相关的活化转录因子如RUNX2、CREB3L1和TWIST1,但是早期的活化转录因子如FOXA2、BHLHE40、FOXC2更应引起我们的关注,他们可能是对OA早期干预更有意义的靶点。结论:本研究描绘了在IL-1β诱导的炎症环境中体外扩增软骨细胞的高维转录组图谱,揭示了炎症进展过程中具有不同功能的多个软骨细胞亚群。鉴定了向终末炎症特异性软骨细胞亚群不断演变的“典型炎症反应路径”,该亚群以及决定向该亚群演化的基因及其表达产物可能代表了OA的新型治疗靶点。WGCNA算法获得了一个具有10个与OA和变性密切相关的基因模块,巨噬细胞浸润以及巨噬细胞共培养体系下软骨细胞功能障碍、炎性因子的失调以及ROS爆发可能是软骨周围组织免疫浸润后OA早期炎症发生的途径。OA的进展过程中早期主导细胞为效应软骨细胞,其接受外部环境影响后,以自分泌和旁分泌形式进行细胞间通讯。进入晚期OA后,主导细胞演变为pre HTC、HTC和pro C。每一个时期中活化的转录因子不尽相同,每一个亚群都具有该亚群独特的活化转录因子。