前言 急性坏死性胰腺炎(ANP)是严重危害人类生命的常见疾病，多年的外科临床实践使人们认识到：本病一旦开始病情可不断恶化，进而发生多脏器功能衰竭而致病人死亡。对此既使应用强效的胰酶抑制剂、甚至手术清除坏死的胰腺组织也难以阻止病情不断发展加重的趋势。以往的临床治疗观点及方案一味针对胰腺自身消化，使治疗始终处于被动局面。自1988年Rindernecht提出急性胰腺炎的白细胞过度激活学说以来，免疫机制在急性坏死性胰腺炎中的重要作用已经得到了广泛的认同。抑制急性坏死性胰腺炎时过度免疫反应的治疗方法也因此成为最有希望的方法。 补体是体液免疫的重要组成部分，其主要生理功能是促进吞噬和溶解靶细胞，对消除外来微生物及抗原的侵害有重要作用；另一方面其过度激活所产生过敏毒素而致的炎症反应可以导致机体正常组织细胞的损伤。补体蛋白因其强烈的致炎症性质及补体攻击复合物(MAC)的强大杀伤力引起了国外一些学者的注意。许多研究结果说明：补体系统激活在急性胰腺炎的病程发展中发挥了重要的作用，参与了机体的炎症反应进程。因此如何抑制补体激活，阻断其扩大的级联反应成为治疗急性胰腺炎的突破口。 补体激活做为一种级联反应受到多种补体调节因子(Regulators of Complement Activation，RCA)的严格控制，这些调节因子中以膜辅助蛋白(MCP)、衰变加速因子(DAF)和膜反应性溶解抑制物(CD59、MIRL)的作用尤为显著。MCP、DAF、CD59这三种补体调节因子膜连于细胞表面，通过抑制补体激活过程中各种关键酶而达到抑制补体级联反应的目的，从而减轻机体的炎症反应。近年来，许多科学家对此三种补体调节蛋白进行了大量的研究，发现这三种RCA在败血症、心肌和肠道的缺血再灌注损伤、急性呼吸窘迫综合征、移植排斥反应等方面发挥了重要的作用。但RCA在急性坏死性胰腺炎中的作用尚未见报道，所以我们着手研究其在ANP中的作用。本研究通过观察大鼠 ANP寸 MCP、DAF、CD59的表达，来阐明RCA在ANP中的作用。 实验材料与方法 一、实验材料 1．主要药物与试剂 牛磺胆酸钠瞩igma公司产品，美国厂 MCP卜c－7056入 DAF（s－9156）、CD59（sc－9157）多克隆抗体（Santa Cruz生物技术公司产品，美国厂链霉亲合素一生物素一过氧化物酶复合物瞩ABC）法免疫组化试剂盒（武汉博土德生物工程有限公司产品，武汉八 2．主要仪器与器材 离心机（SIMENS，德国入深低温冰箱（MDF－U40856入冰冻切片机（BRIGHT1512，英国）。 3．实验动物 Wistar鼠50只（中国医科大学实验动物中心提供人 二、实验方法 l．实验动物分组：Wist。大鼠 50只，雌雄不拘，体重 180－200克，随机分为5组，一个正常对照组和四个ANP组（分别为胰腺炎3、6、12、24 h组），每组10 只。 2．急性坏死性胰腺炎模型的建立：采用逆行注射法制作ANP模型。用2％的戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉”．Indl00g体重厂进人腹腔后显露胰腺，从乳头处的十二指肠壁进针，逆行穿刺胆胰管，动脉夹阻断肝门端，以0．Zndmin的速度向胆胰管内匀速注人体积分数为 5％的牛磺胆酸钠厂 体重L注射后用动 ·2· 脉夹夹闭穿刺处5分钟，以防药液溢出。对照组开腹后仅翻动胰 腺。 3．标本的采集和处理：．对照组直接取材，ANP组分别于模型 制成后3为＊、24小时重新麻醉开腹，抽血后处死动物，取血液上 清及十二指肠窗内的胰腺组织，置于一70℃的冰箱中保存待测。 4．血清淀粉酶J肪酶测定：碘比色法、浊度法分别测量血淀 粉酶J肪酶。 5．免疫组化检测及 HI：染色：标本用冰冻切片机切成 5 pm的 切片。免疫组化采用链霉亲合素一生物素一过氧化物酶复合物 瞩ABC）法：3％H刃。室温下 10分钟以灭活内源性酶；正常山羊血 清封闭20分钟；效价为1：150的MCP（SC－7056）、DAF（SC－ 9156）、CD59 （s一9157）一抗，4℃过夜；生物素化山羊抗J鼠 I亦0分钟；SABC室温下20分钟；DAB显色室温下5分钟，苏木 素复染、脱水、透明、中性树胶封片。阴性对照采用PBS代替一 抗，用血管内皮细胞作为阳性对照。常规HE染色。 6．免疫组化结果判定：细胞膜呈棕黄色为阳性。按阳性细胞 分布范围半定量评分：无阳性细胞或轻度着色J性细胞数小于 10％）计为（一八 10－50％细胞特异性着色计为（＋入50－90％细 胞解性着色计为（＋＋＊90－100％细胞特异性着色计为（＋＋ ＋人最终结果是由两位病理学医生用双盲法分别观察每例切片 所获得的一致意见。 7．胰腺坏死程度判断：按 Kuske的方法对胰腺坏死程度评 分刃分－没有坏死；二分－导管周围实质破坏；2分－局部实质坏 死＜20％；3