新城疫病毒（newcastle disease virus, NDV）是一种天然的溶瘤病毒，能选择性引起肿瘤细胞死亡，同时， NDV的血凝素-神经氨酸酶（hemagglutinin-neuramidinase，HN）和融合蛋白（fusion protein，F）可以诱导细胞融合，形成多核巨细胞，即细胞合胞体。本课题以NDV强毒株——Italien株为研究对象，探讨其感染肿瘤细胞引起的合胞体形成及其死亡机制。本论文分为三个部分：第一部分：NDV Italien对肿瘤细胞的杀伤作用目的：检测NDV感染肿瘤细胞后引起的细胞病变效应和对肿瘤细胞的杀伤率。方法：利用无特定病原种蛋培养NDV Italien，3天后收集鸡胚尿囊液，浓缩纯化得到病毒悬液。采用TCID50（median tissue culture infective dose）法测定病毒悬液的含量。然后以不同剂量的NDV感染肿瘤细胞，应用光学显微镜观察病毒引起的细胞病变效应，同时测定其对肿瘤细胞的杀伤作用。结果：NDV经鸡胚培养和超速离心纯化浓缩后，获得了高滴度的NDV病毒悬液（1010-1011TCID50/ml）。MTT细胞毒性实验显示，病毒感染肿瘤细胞后细胞存活率显著下降，表明NDV Italien毒株对肿瘤细胞有很强的细胞杀伤能力。同时苏木精-伊红染色显示，病毒感染肿瘤细胞引起了细胞与细胞之间广泛的融合，最终形成了大量细胞合胞体。第二部分：NDV Italien诱导细胞合胞体的形成及死亡目的：研究NDV诱导细胞融合形成的合胞体的命运及作用机制。方法：NDV Italien感染肝癌细胞SMMC-7721，采用TUNEL染色法检测合胞体死亡。利用JC-1检测病毒感染肿瘤细胞后细胞的线粒体膜电位；同时检测细胞ATP的水平变化以及NDV病毒粒子和线粒体的共定位关系。结果：病毒感染细胞后形成的合胞体TUNEL染色呈阳性，表明合胞体细胞中的DNA发生断裂；通过JC-1检测，在荧光显微镜下发现，合胞体细胞的线粒体膜电位明显下降；ATP水平的显著降低（P <0.01），表明合胞体的死亡与线粒体密切相关。但透射电镜实验并未发现病毒在线粒体的定位，提示病毒引起的线粒体改变，可能不是通过病毒与线粒体直接发生相互作用的方式引起的。第三部分：NDV的HN和F蛋白在细胞合胞体形成及死亡中的协同诱导作用目的：探讨NDV Italien包膜蛋白HN和F在合胞体形成及死亡中的协同作用。方法：利用HN和F的真核表达质粒pcDNA-HN和pcDNA-F共转染BSR-T7/5细胞，活细胞动态观察细胞融合。pcDNA-HN和pcDNA-F共转染SMMC-7721或BSR-T7/5细胞，通过间接免疫荧光技术、PI染色以及TUNEL染色来检测细胞合胞体的形成和死亡。同时检测两种质粒共转染的BSR-T7/5细胞中的ATP水平。利用透射电镜观察共转染细胞的超微结构。结果：活细胞动态观察显示质粒pcDNA-HN和pcDNA-F共转染BSR-T7/5细胞后细胞发生融合且形成的合胞体逐渐死亡。免疫荧光实验显示，质粒pcDNA-HN和pcDNA-F共转染肿瘤细胞SMMC-7721或BSR-T7/5细胞后，细胞发生融合并形成合胞体；SMMC-7721细胞共转染后继续培养48h，PI染色表明合胞体呈阳性，提示合胞体细胞发生死亡；同样，BSR-T7/5细胞共转染后，经PI和TUNEL染色表明合胞体形成并最终死亡；而单独转染pcDNA-HN或pcDNA-F则没有引起细胞死亡，同时对照组中聚乙二醇虽然能引起细胞膜融合，但未见合胞体细胞死亡。在质粒共转染的BSR-T7/5细胞中，与对照组相比，两种质粒共转染引起ATP水平显著降低（P <0.05），说明病毒膜蛋白的共同作用影响线粒体代谢。上述结果提示，NDV感染引起的合胞体死亡与HN和F蛋白的协同作用有关，并且这一效应可能与病毒基因组的复制以及单纯的细胞膜融合无关。利用透射电镜进一步发现，共转染组融合细胞内出现了较多的典型自噬空泡，而单转染组则未见有明显的自噬空泡。Western blot检测到质粒共转染的细胞中自噬相关蛋白Beclin1表达水平上调。全文结论：1）NDV Italien感染肿瘤细胞引起细胞病变，形成细胞合胞体并最终死亡。2）NDV病毒包膜蛋白HN和F的协同作用可以诱导合胞体的形成并导致其死亡。3）HN和F蛋白引起细胞合胞体发生自噬，可能是合胞体死亡的诱因，相关工作还需进一步研究。