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奶牛乳房炎是威胁奶牛养殖业的重要疾病之一,可引起奶牛产奶量下降和牛乳品质降低,严重阻碍全球乳产业的发展。肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和单增李斯特菌（Listeria monocytogene）感染是导致牛乳房炎的主要因素。迄今为止,抗生素仍然是治疗乳房炎的重要抗菌药物。但是,由于不合理的使用和滥用抗生素,加速了细菌耐药性的发展,并导致多重耐药菌的不断产生。因此,迫切需要有效的措施恢复致病菌对抗生素的敏感性。目前应对细菌耐药性的全球性的策略主要有:加强耐药监测、合理使用抗生素、开发新型抗菌药物和恢复或增强现有抗生素的抗菌活性等。天然酚类化合物具有来源广泛、毒副作用小、不易产生耐药性,与抗生素联合使用具有协同抗菌作用等优点,因此,其在应对细菌耐药性问题中具有广阔的应用前景。咖啡酸作为重要的酚类化合物之一,广泛存在于水果、蔬菜和谷物中,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等常见致病菌具有较广谱的抗菌活性,与抗生素联用可消减细菌的耐药性,且能增强多重耐药菌对常用抗生素的敏感性。因此,为了探究咖啡酸是否能提高主要牛源性耐药病原菌的药物敏感性及其作用机理,本研究首先采用药敏纸片法测定三种牛源性致病菌的耐药谱,并通过肉汤稀释法测定抗生素和天然产物（咖啡酸、花青素和肉桂醛）的抑菌活性,然后,通过棋盘试验筛选出与抗生素存在着协同抗菌作用的天然产物以及它们的最佳浓度组合,其次,采用杀菌时间分析来比较最佳浓度组合与单一抗菌药物作用后活菌数的变化情况,分析天然产物联合抗生素对牛源性致病菌耐药性的消减作用;最后,通过分光光度法测定β-内酰胺酶的活性,荧光染色法测定细胞膜的完整性,荧光分光光度法测定外排泵的活性,显微镜观察细胞膜与生物膜结构的变化以及荧光定量PCR（RT-qPCR）定量耐药相关基因（抗生素水解酶基因、外排泵基因和孔蛋白基因）的表达等研究咖啡酸和磺胺甲恶唑单独或者联合使用对三种牛源性致病菌耐药性的消减作用机理,以期为解决细菌耐药性难题及消减细菌耐药性的作用机制的进一步探究提供理论基础,为咖啡酸等酚类化合物作为安全有效的新型协同抗菌剂的开发与应用提供新的策略。本研究的主要结果如下:1.肺炎克雷伯氏菌（K.p 305）、金黄色葡萄球菌（S.a 302）和单增李斯特菌（L.m6）分别对22、15和16种抗生素耐药,抗生素的MIC值高达＞512 μg/mL,相对而言,K.p 305的耐药谱最广;咖啡酸和花青素对三株菌均具有较好的抑菌作用,而肉桂醛对K.p 305几乎无抑菌作用。2.咖啡酸通过将抗生素的MIC值最多降低≥ 4096倍显著增强抗生素对三种牛源性耐药菌的抗菌活性,而花青素仅能将四种抗生素的MIC值降低4倍从而增强三株耐药菌对抗生素的敏感性;咖啡酸与磺胺甲恶唑或氯霉素联合作用24 h后,与单一抗生素或咖啡酸相比,K.p 305的活菌数分别至少减少2.62 log、2.61 log,S.a 302的活菌数分别至少降低2.18 log、2.03 log,L.m6的活菌数分别至少减少2.71 log、2.38 log,表明咖啡酸与磺胺甲恶唑/氯霉素联用对K.p 305、S.a 302和L.m6均具有协同杀菌作用。3.磺胺甲恶唑（1/256 MIC）联合咖啡酸（1/2 MIC）能显著抑制K.p 305、S.a 302的β-内酰胺酶活性,酶的比活力分别降低至为108.2±42.2和205.1±49.5 nmol/min/mg,而对L.m6几乎无影响;亚抑制浓度的咖啡酸通过增强菌体内磺胺甲恶唑的蓄积量对三株耐药菌的外排泵活性呈现出浓度依赖性抑制作用;其中,1/2 MIC咖啡酸最多能将K.p 305、S.a 302和L.m6体内的磺胺甲恶唑蓄积量分别增加 75%、69%和 69%。4.通过扫描电镜观察细胞膜结构以及共聚焦激光扫描显微镜观察SYTO 9和PI两种荧光强度的变化,探究咖啡酸与磺胺甲恶唑的组合对三株牛源性耐药菌细胞膜结构的影响。结果表明,咖啡酸（1/2MIC）与磺胺甲恶唑（1/256 MIC）联用对细胞膜的完整性有协同破坏作用,增强细胞膜通透性,提高磺胺甲恶唑的摄入量,咖啡酸与磺胺甲恶唑协同杀菌,三株耐药菌失水皱缩并释放大量细胞内容物,细胞被瓦解。5.咖啡酸（1/2 MIC）与磺胺甲恶唑（1/256 MIC）联合使用对L.m6、K.p 305和S.a 302生物被膜的抑制率分别高达84.6%、81.1%和75.3%;咖啡酸与磺胺甲恶唑联用对胞外多糖（EPS）及胞外蛋白的抑制作用与其对生物被膜的抑制率呈正相关,对L.m6、K.p 305和S.a 302的EPS抑制率分别为51.8%、51.1%和50.8%,对胞外蛋白的抑制率分别为52.6%、51.3%和50.8%;另外,它们的组合能显著破坏生物被膜的结构,将聚集的微生物群落显著分散开,加速磺胺甲恶唑到达靶点,增强抗生素的杀菌活性,最终杀死生物被膜内的细菌。6.咖啡酸（1/2MIC）与磺胺甲恶唑（1/256MIC）联用能将K.p 305、S.a302和L.m6的编码抗生素水解酶基因分别下调2～17倍、3～10倍和4～9倍,从而增强三株耐药菌对抗生素的敏感性;通过将外排泵基因分别下调4～8倍、3～6倍和6～8倍,极大程度的抑制外排泵系统主动泵出磺胺甲恶唑,此外,它们的组合还可将三株菌的磺胺类抗生素抗性基因（sul2）分别最高下调12.75、10.05和9.42倍,表明咖啡酸与磺胺甲恶唑之间存在协同抗菌作用,显著提高了磺胺类抗生素对三株耐药菌的有效杀菌作用。综上,本研究表明咖啡酸能通过降低抗生素的MIC值有效消减三种牛源性致病菌的耐药性。咖啡酸主要通过抑制β-内酰胺酶活性、外排泵活性和生物被膜的形成,破坏细胞膜结构的完整性以及下调耐药相关基因的表达等作用机制消减细菌耐药性。