细胞质Dynein是一类能与微管结合马达蛋白,是细胞内物质运输的主要驱动力之一。目前有证据显示无脑回综合症致病基因Lis1 (Lissencephaly 1)可能参与了Dynein运动能力的调节。在曲霉菌中,细胞核分布基因nudC nuclear distribution gene C)可能是Lis1的同源基因nudF (nuclear distribution gene F)的上游基因,nudC突变将极大降低NudF的蛋白水平。这样,NudC、Lis1和Dynein(其重链是细胞核分布基因nudA的同源基因)等组成了一条从曲霉菌到哺乳类进化上非常保守的调节通路。在哺乳动物中,Lis1/Dynein通路更加复杂化和网络化。NudC和Lis1各自存在其同源物,协同这两个蛋白共同发挥作用。这些蛋白和Dynein形成巨大的复合物,共同参与细胞内物质运输、细胞周期和细胞迁移的调控。同时,这条通路上的蛋白大都定位于中心体或沿着微管分布。而中心体作为微管组织中心影响了细胞内绝大多数与微管相关的过程,包括细胞有丝分裂、胞质分裂、细胞内物质转运和细胞迁移。因此,Lis1/Dynein通路的重要性越来越被人们所广泛认识。但是,目前在这条通路中还有一些成员没有被发现,而且已发现的蛋白之间的相互作用的具体机制也并不完全清楚。近年来我们实验室一直从事这条通路上新成员的鉴定以及相互调控机制的研究。在这里我们重点研究了Lis1/Dynein通路中的两个新成员：NudC同源蛋白NudCL (Nuclear distribution gene C Like)和Lis1相关蛋白Twal (Two hybrid associated protein No.1 with RanBPM),并首次观察到了这两个蛋白都定位于中心体上。为了进一步明确NudCL和Twa1的生物学功能,阐明Lis1/Dynein通路的分子调控机制,我们从细胞水平和模式动物胚胎发育的角度来系统研究这两个蛋白的功能。第一部分中心体相关蛋白NudCL在细胞胞质分裂及细胞增殖中的作用我们实验室先前的工作发现NudCL在高尔基体上有定位,并能通过调节Dynein中间链(Dynein Intermediate Chain, DIC)的稳定性影响细胞有丝分裂的正常进行。这里,我们通过免疫荧光实验发现NudCL蛋白在细胞间期定位于中心体上,在有丝分裂中期富集在纺锤体的双极(spindle poles),在胞质分裂期则集中到中体部位(midbody)。细胞计数和MTT实验显示在哺乳类细胞中过量表达NudCL可以抑制细胞增殖。免疫荧光实验发现NudCL过量表达会导致细胞出现多核现象。实时显微摄影技术结合免疫荧光技术显示,过量表达NudCL后大部分多核细胞的胞质分裂出现异常,主要表现为中体处微管结构的紊乱或中体环的消失。此外,NudCL过量表达还能引起细胞有丝分裂期时间延长,多极纺锤体的出现和染色体分向两极的滞后等一些有丝分裂过程中的异常现象。通过RNAi实验降低NudCL的表达水平我们还发现除了之前已经报道的导致有丝分裂中期染色体排列异常、出现哑铃形细胞核、导致细胞死亡等一些现象以外,在一些越过M期阻滞的细胞中也出现胞质分裂的异常。这些结果提示NudCL可能除了前期发现的在有丝分裂中期的作用外,在胞质分裂期对中体结构的正确形成和两个子代细胞之间连接的剪断可能都有重要的意义。第二部分中心体相关蛋白Twa1在细胞迁移和胚胎发育中的作用无脑回综合症致病基因Lis1是一个在神经细胞迁移、细胞增殖和存活等过程中扮演重要角色的基因。在小鼠中剔除Lis1基因,小鼠在胚胎发育早期即死亡。人类的Lisl基因突变会导致Ⅰ型无脑回综合症(Lissencephaly),患者大脑皮层平滑,智力低下,寿命短,常有癫痫发作。然而,至今为止尚无LIS1家族成员的报道。我们通过生物信息学分析,发现了在进化上高度保守的Twa1是一个具有Lis1同源结构域(LisH结构域)和LisH羧基端结构域(CTLH结构域)蛋白质。已有报道表明Twa1在细胞核中有定位,并能和RanBPM (Ran-binding protein M)釉Muskelin相互作用,但其功能一直不明。我们的研究发现Twa1除了定位于细胞核里外,在中心体上也有明显定位,能在体内与Lis1/Dynein相结合。愈伤实验和Transwell实验显示,在细胞中降低Twal的蛋白水平会导致细胞迁移受阻。进一步研究发现Twal被降调的细胞在了leading edge处的Dynein分布缺失。此外过量表达缺失LisH功能结构域的Twal突变体也会导致细胞迁移受阻。RT-PCR半定量分析和原位杂交显示,在爪蟾胚胎发育过程中Twal在原肠形成时期(第10-13期)和器官形成时期(第19-30期)表达量较高；并且其表达主要集中在胚胎头部,特别是眼部和脑部。在爪蟾胚胎中显微注射缺失LisH功能结构域的Twal突变体质粒会导致胚胎头部发育严重畸形,严重时会导致死亡。这些结果提示Twal可能与Lis1有部分类似的功能,能参与细胞迁移过程,并在胚胎早期发育,特别是脑和眼部发育中起重要作用。以上研究表明,Lis1/Dynein通路中NudCL在细胞胞质分裂中发挥重要作用,Twal则能通过影响细胞迁移进而影响胚胎早期发育过程。通过对这两个新成员的研究,使我们对Lis1/Dynein通路有了更加广泛和深入的了解,也为我们进一步了解中心体蛋白在细胞生命活动的各个方面发挥的功能提供了新的线索。