家蚕是一种典型的鳞翅目昆虫,栽桑养蚕在我国有着5000年以上的悠久历史,蚕桑生产是我国的传统优势产业,然而蚕病给养蚕业造成很大的损失。由于产业发展的需要,家蚕的免疫防御机制是人们长期关注的热点。开展家蚕免疫相关基因的功能研究,一方面将为阐明家蚕对病原微生物的免疫应答和昆虫免疫系统的进化的分子机制奠定基础,也将为培育高抗病能力的家蚕品种提供理论依据。另一方面,由于半数以上的粮食作物和森林害虫属于鳞翅目,家蚕作为第一个全基因组测序的鳞翅目昆虫,其免疫基因功能的研究对鳞翅目昆虫特异免疫相关基因的分离克隆和功能阐释,对害虫防治新途径和新型环保型农药的开发等都具有重要意义。　　本论文通过利用生物信息学、分子生物学等多种方法,克隆并鉴定了家蚕免疫相关基因spatzle4(spz4),并对其进行组织及诱导表达分析。具体研究结果如下:　　1.家蚕spatzle4基因的克隆　　以家蚕5龄第3天幼虫表皮组织提取RNA,以RNA为模板,反转录合成cDNA第1链,然后利用已知序列设计引物进行PCR,克隆测序。现已克隆出家蚕spatzle4蛋白基因的完整开放阅读框。我们还利用3’-RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术得到目的基因的3’非翻译区。　　2.家蚕spatzle4基因的结构及其分子进化分析　　家蚕spatzle4的结构与序列分析表明该基因位于第3号染色体上,在基因组中只有1个拷贝。该基因有4个外显子,3个内含子,编码425个氨基酸残基,分子质量为49.36 kD,等电点为5.31。N端预测没有信号肽。BmSPZ蛋白疏水性最大值为1.733,最小值为-3.011,蛋白质基酸序列的疏水和亲水区域交错排列。SPZ样蛋白没有跨膜结构。BmSPZ氨基酸序列与蜜蜂、埃及伊蚊、赤拟谷盗、致倦库蚊、冈比亚按蚊、丽蝇蛹集金小蜂、果蝇和豌豆蚜的SPZ亲缘关系较近,而与哺乳动物的SPZ亲缘关系相对较远。　　3.家蚕spatzle4基因的组织表达及微生物诱导表达分析　　用5龄第3天家蚕幼虫各组织RNA进行RT-PCR的半定量分析,研究结果表明,该基因在家蚕5龄第3天幼虫不同组织中有不同水平的表达,其中以头部中的表达量相对最高,其次在表皮,精巢中有少量表达,其余组织中没有检测到此基因的表达。　　向五龄三天的家蚕幼虫体表,分别注射无菌ddH2O、经福尔马林处理过的大肠杆菌,芽孢杆菌,酵母菌。微生物注射24小时后,取家蚕幼虫表皮组织,提取总RNA,进行半定量分析。结果表明大肠杆菌的注入不能使家蚕spatzle4的表达量发生变化,而芽孢杆菌及酵母菌的注射使家蚕spatzle4的表达量升高。说明革兰氏阳性菌及真菌能诱导家蚕spatzle4的表达量提高。研究表明,果蝇对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及真菌具有不同的免疫诱导途径。我们的实验结果与果蝇的不同种类微生物的诱导结果一致。　　4.荧光假单胞菌Pf-1基因的克隆及其该菌对家蚕的感染性研究　　在从家蚕功能基因的克隆过程中我们扩增出一序列片段,克隆测序后将所得序列在NCBI中做blastn检索,发现这段序列与荧光假单胞菌SWB25中的PFLU5794基因有着约95％的同源性。推测实验选用的家蚕可能被荧光假单胞菌感染。随后我们将几种假单胞菌以家蚕体表注射的方式进行人工感染试验,证实了这几种菌对家蚕的致病性。