实验目的系统性结缔组织病（connective tissue disease，CTD）如系统性硬化症（systemic sclerosis，SSc）、混合结缔组织病（mixed connective tissue disease，MCTD）、多发性肌炎（polymyositis，PM）以及系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）等常伴发肺血管病变，部分可最终导致肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）。合并PAH的CTD患者预后极差，以SLE、SSc及PM混合出现为特点的MCTD患者中，几近半数死因要归于PAH。然而，系统性CTD患者发生肺血管损伤的相关机制目前尚不十分清楚。小核核糖体蛋白（small nuclear ribonucleoproteins，snRNPs）是一组由小RNA及其相连多肽组成的核糖体蛋白颗粒，弥漫散在地分布于细胞核质内，主要参与前mRNA的剪切过程。CTD患者血清中常可检出抗snRNPs自身抗体。snRNPs包括多种抗原如U1、U2、U5、U4／U6等，其中含量最丰富的是U1RNP。绝大多数snRNPs都包含一种SmRNP核心结构，通过免疫沉降法可沉淀出所有含Sm核心结构的RNP抗原。抗U1RNP抗体阳性是MCTD的诊断依据之一，MCTD患者血清抗U1RNP抗体滴度明显升高。抗U1RNP抗体阳性的MCTD患者PAH的发生率较高，PAH是抗U1RNP抗体阳性患者预后不良的重要危险因素。研究表明，抗U1RNP抗体可上调人类肺动脉内皮细胞（human pulmonary artery endothelial cell，HPAEC）表达细胞间粘附分子-1（intercellular cell adhension molecule-1，ICAM-1）、内皮细胞白细胞粘附分子-1（endothelial leucocyte adhesion molecule-1，ELAM-1）以及MHCⅡ类分子，通过免疫反应参与肺动脉血管病变的形成。抗U1RNP抗体介导的免疫反应，可最终导致CTD患者出现PAH。抗U1RNP抗体与CTD患者的PAH的形成有关，但不是唯一因素。研究显示，除外抗U1RNP抗体，其它抗原特异性自身抗体如抗内皮细胞抗体（anti-endothelial cell antibody，AECA）在PAH的发生、发展过程中也发挥一定作用。临床上大多数MCTD患者并不合并PAH，反之，许多合并PAH的CTD患者的血清中亦不存在抗U1RNP抗体。近年来研究发现，在系统性自身免疫疾病患者的血清中常可检出AECA，并显示AECA与动脉血管内皮损伤有关。因此，我们推测CTD患者外周血中，存在特异性抗HPAEC自身抗体，它们不同于抗RNP抗体等抗核抗体，可特异性地与HPAEC抗原结合，通过自身免疫性炎症反应参与肺动脉血管损伤及PAH形成。这种特定部位抗原抗体反应所致的肺动脉血管内皮炎症可能是CTD患者发生PAH的机制之一。AECA同HPAEC抗原表位结合后，可能作为刺激信号改变HPAEC的功能状态。有资料证实，AECA可上调内皮细胞E-选择素、ICAM-1及VCAM-1的表达，诱导内皮细胞分泌白介素-1β（imerleukin-1β，IL-1β）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）和白介素-8（interleukin-6，IL-8）；还可活化血管内皮细胞，产生白细胞趋化因子如RANTES（Regulated Upon Activation，Normal T-cell Expressed and Secreted，活化T细胞调节的正常T细胞表达和分泌的因子）及淋巴细胞活化共刺激分子。RANTES是单核细胞及T细胞的重要趋化因子，具有控制单核细胞和淋巴细胞定向迁移的免疫学特性，通过促进白细胞募集、粘附以及内皮细胞活化诱发炎症反应，造成血管内皮损伤。PAH患者肺组织原位杂交及免疫组化分析发现，内皮细胞是RANTES的主要来源，PAH患者肺组织中RANTES mRNA水平明显升高。另外，RANTES通过间接诱导内皮细胞转换酶-1和内皮素-1的产生，促进PAH形成。目前，关于MCTD患者PAH发病机理的研究逐渐增多，但自身抗体介导的肺动脉血管损伤机制以及HPAEC本身在血管损伤过程中的作用仍不清楚。我们推测，抗HPAEC自身抗体在系统性自身免疫疾病患者PAH发生中起一定作用，HPAEC本身可能也参与血管炎的发生。临床抗U1RNP抗体阳性患者肺损伤多见，且有研究显示抗U1RNP抗体与肺血管内皮损伤相关，本研究选择抗U1RNP抗体阳性血清作为研究对象，检测血清特异性抗HPAEC抗体，探讨该抗体同抗U1RNP抗体之间的关联性，并观察其对HPAEC分泌RANTES的影响，在此基础上分析抗HPAEC抗体在肺动脉血管免疫损伤中的作用，以期阐明CTD患者PAH的发病机制，为更有效临床治疗药物的研制开发提供新的理论和实验依据。实验方法一、RNA-免疫沉降法（RNA-IPP）筛选抗U1RNP抗体阳性血清2mg sepharose CL-4B蛋白A与500μl IPP缓冲液均匀混合后，加入10μl患者血清，4℃翻转混合2h。血清抗体包被的cepharose颗粒用500μl IPP缓冲液冲洗3次后与细胞抗原反应，抗原用Hela细胞制备（每个标本6×10⁶个细胞）。HeLa细胞加入0.3ml NET-2缓冲液中，经超声裂解后，收集细胞裂解液上清，加入400μl NET-2缓冲液，其中含有抗体包被的cephalose颗粒，4℃孵育2h。反应后的颗粒，经NET-2缓冲液洗涤3次并离心后，加入270μl NET-2缓冲液，30μl 3M醋酸钠溶液，15μl 20％SDS溶液，其中RNA经phenol／chloroform／isoamyl alcohol（50：50：1）提取后用3倍体积的乙醇沉淀析出后，经10％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶电泳分离，最后通过银染色显影。二、蛋白质免疫印记杂交检测血清特异性抗HPAEC抗体（一）细胞抗原的制备HPAEC购自日本KURABO公司，经血管内皮细胞专用培养基（HuMedia-EG2）培养。使用前细胞用Trypsin／EDTA溶液自细胞培养瓶分离，中和液中和，PBS洗涤3次。HPAEC经细胞裂解液（10mM Tris-Hcl，150mM NaCl，lmM EDTA，1mM EGTA，1％Nonidet P-40，0.2％SDS，10mM NaF，2mM Na₂VO₄）裂解。裂解后的细胞液与等量的SDS样品缓冲液混合后保存，调整细胞浓度至2000个／μl。同时制备HeLa细胞作为对照。细胞裂解液使用前于-80℃保存。（二）蛋白质免疫印记杂交裂解细胞液煮沸后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至硝酸纤维素膜（NC膜）后与血清孵育。同一份血清同时与HPAEC和HeLa反应，每个电泳槽20μl裂解细胞液。NC膜用含5％脱脂奶粉的PBS封闭，于4℃过夜。用PBS-NP40（含有0.05％NP40的PBS）洗涤3次后，NC膜同患者血清（以PBS做1：100稀释）于室温反应3h。PBS-NP40洗涤3次后，NC膜于羊抗人IgG（H+L）的PBS（1：7500，Promega，Corp．USA）中孵育2h。再次用PBS-NP40洗涤3次，NC膜上结合的IgG蛋白经BCIP／NBT显影观察。以上所有的孵育反应过程均在封闭的聚乙烯透明袋中进行。三、抗-HPAEC特异性抗体洗脱印记杂交为分析抗HPAEC抗体同其它自身抗体的结构相关性，NC膜上同HPAEC抗原结合的自身抗体，用ImmunoPure IgG洗脱缓冲液（PIERCE，USA）洗脱。含有目的抗体的NC膜，置于3ml洗脱缓冲液中，震荡5min后，收集洗脱液。另取3ml洗脱缓冲液，重复上述过程一次。于最后收集的6ml洗脱液中加入800μl 1M Tris-HCl（PH 7.5），调整pH值至7.0。血清IgG抗体洗脱液，进一步同HPAEC和HeLa细胞抗原杂交反应。四、流式细胞分析术检测细胞表面抗原（一）细胞的收集用0.01％EDTA／PBS（含钙离子）10-20ml冲洗细胞培养瓶，适当用力拍打，使附壁生长的HPAEC从内壁解离。重复两次，收集所有细胞悬液，至计数后平均每个样品细胞数2～4×10⁴个。HeLa细胞则直接取出同样数量细胞的细胞悬液。用2％FCS／PBS液洗涤两次后，离心，各留取约2ml的细胞悬液。（二）细胞样品荧光抗体染色每一个染色管中加入200μl的细胞悬液后，加入2μl血清。混匀后4℃避光反应1h。每管加入2％FCS／PBS溶液2ml，低温离心（2000rpm，5min），洗涤两次，弃上清。待检样品用1μl anti-Human IgG-FITC标记染色，另设阴性对照管及阳性对照管，阴性对照不加荧光抗体，阳性对照加入anti-Human CD54 IgG-Biotin及Avidin-FITC各1μl，混匀后4℃避光反应1h。用2％FCS／PBS洗涤两次后，弃上清，静置15min后，上机。（三）流式细胞仪检测调定参数后，通过流式细胞仪，利用FACS CELLQUEST软件获取细胞，每个样品分析15，000个细胞，以阴性对照为参考，对所检测标本进行定性分析，阳性对照管所在区域设为阳性分析结果。五、分离纯化血清IgG抗体患者血清IgG抗体应用ImmunoPure IgG（PIERCE，USA）纯化分析试剂盒分离纯化。血清用结合缓冲液1：1稀释后，10，000rpm离心20min。取上清加至蛋白AIgG亲和分离柱中。样品与蛋白A琼脂糖凝胶充分作用后，用15ml结合缓冲液冲洗。结合的IgG用5ml洗脱缓冲液洗脱，洗脱液用500μl结合缓冲液中和。通过酶标仪280nm测定IgG浓度。六、ELISA方法测定细胞培养上清RANTES浓度分离出的IgG抗体加至HPAEC的培养液中，调整IgG的终浓度至1mg／dl。孵育48h后，收集培养上清。用ELISA（R&D SYSTEMS，USA）试剂盒检测上清中RANTES含量。通过酶标仪于540nm波长读取OD值，用SoftMax Pro 4.3.1 LS软件分析数据，绘制标准曲线，计算RANTES含量（pg／ml）。实验结果一、RNA-IPP筛选血清通过RNA-IPP分析法，选出抗U1RNP抗体阳性血清64例。其中SLE 31例，MCTD14例，SSc 3例，类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）2例，干燥综合征2例，PM、未分化CTD及皮肤型红斑狼疮患者各1例，另有9例患者的诊断尚不十分明确。64例中有4例合并PAH。二、免疫杂交分析检测抗HPAEC自身抗体通过RNA-IPP筛选的64例抗U1RNP抗体阳性血清标本中，其中有37例含有一种针对HPAEC31kDa抗原（HPA31）的抗体。37例抗HPA31抗体阳性标本中有14例可同时检测到与HPAEC 90kDa抗原（HPA90）反应的自身抗体。两种抗HPAEC抗体出现的阳性率分别为57.8％（37／64）和21.9％（14／64）。抗HPA31抗体在HeLa细胞抗原检出阳性率仅为9.4％（6／64），而在抗HPA31抗体阴性的血清和以HeLa细胞为抗原的反应中，抗HPA90抗体均未检出。提示HPA31和HPA90抗原主要在HPAEC上表达，抗U1RNP抗体阳性患者血清中存在特异性抗HPAEC的自身抗体。抗HPA31抗体和抗HPA90抗体，在4例合并PAH患者血清有3例出现阳性，2例抗U1RNP抗体阴性合并PAH者及健康志愿者血清中两种抗体均阴性。另外，与HeLa细胞抗原反应时，37例抗HPA31抗体阳性的标本中有33例，同时检测出抗32kDa及30kDa抗原的自身抗体（抗32／30kDa抗体），出现的比率为89％。提示HeLa细胞的32／30kDa蛋白同HPAEC的31kDa蛋白、或者它们的抗体之间可能存在某种关联。三、抗HPA31抗体同抗U1、U2、SmRNP抗体及抗U1RNP-B’／B、A、70K抗体相关性分析RNA-IPP分析发现，64份抗U1RNP抗体阳性血清，其中37例抗HPA31抗体阳性，而抗U1RNP抗体阴性血清则未检出抗HPA31抗体。抗U1RNP抗HPA31抗体的检出与抗U1RNP抗体存在显著的相关性。抗HPA31抗体阳性血清中，抗U2RNP抗体及抗Sm抗体阳性者分别为11份和7份，仅占30％及19％。同抗HPA31抗体阴性组相比，均无显著性差异。免疫印迹杂交结果显示，抗HPA90抗体仅见于抗HPA31抗体阳性血清标本，在抗HPA31抗体阴性标本中则未检出，抗HPA90抗体与抗HPA31抗体具有显著相关性（P＜0.001）。抗HPA31抗体阳性37例中有27例抗U1RNP-B’／B抗体阳性，占73％，而抗HPA31抗体阴性27例中仅有6例阳性，占22.2％（x²=16.097，P＜0.005）。抗HPA31抗体的出现同抗U1RNP-B’／B抗体有相关性。抗HPA31抗体阳性的血清，抗U1RNP-A和抗U1RNP-70K的自身抗体的检出率分别为67.6％（25／37）以及37.8％（14／37），其中抗U1RNP-A抗体在抗HPA31抗体阳性组出现的比率明显高十抗HPA31抗体阴性组（x²=7.346，P＜0.01）。在抗-U1RNP抗体阴性及健康对照者的血清中，抗U1RNP-B’／B，A及70K抗体均阴性。抗HPA31抗体的检出与抗U1RNP-B’／B抗体及抗U1RNP-A抗体有关联。四、抗HPAEC抗体洗脱印记分析抗HPA31抗体和抗HPA90抗体洗脱液，分别同HPAEC及HeLa细胞抗原行免疫印记杂交分析。结果显示，抗HPA31抗体不仅同HPA31抗原反应，同时识别HPA90抗原。但抗HPA31抗体不能识别U1RNP-B’／B、A及70K抗原，也不能同HeLa细胞上的任何抗原（包括30kDa及32kDa抗原）反应。表明抗HPA31抗体同抗U1RNP-B’／B、A和70K抗体以及同HeLa细胞30kDa及32kDa抗原的抗体无交叉反应；抗HPA90抗体经洗脱杂交反应后发现，它可以和HPA31抗原以及HeLa细胞的50kDa，32kDa和30kDa抗原发生反应。以上结果说明抗HPA90抗体与抗HPA31抗体之间有交叉反应性，并且提示HPA90与HeLa细胞50kDa，32kDa和30kDa的抗原及相应抗体之间存在关联。五、流式细胞分析检测HPAEC表面抗原6份抗HPAEC阳性血清中有4份可以检测到与HPAEC表面抗原反应的抗体，而所有抗HPAEC阴性的血清中均未检出。HeLa细胞表面与血清抗体结合的表面抗原均为阴性。提示与HPAEC特异性抗体反应的抗原存在于细胞的表面，且主要在HPAEC上表达。六、抗HPA31抗体对HPAEC分泌RANTES的影响抗HPA31抗体阳性血清纯化分离的IgG抗体加入HPAEC的培养上清，共同孵育后，上清中RANTES的平均浓度为23.1pg／ml，而抗HPA31抗体阴性者，RANTES的平均浓度仅为13.1pg／ml。两者间差异显著（t=2.197，P＜0.05）。提示，抗HPA31抗体对HPAEC分泌RANTES有促进作用。结论1、CTD患者血清中存在与HPAEC反应的特异性IgG抗体，该抗体可识别HPAEC分子量为31kDa（HPA31）和90kDa（HPA90）的抗原。2、抗HPA31抗体的检出同抗U1RNP抗体、抗U1RNP-B’／B抗体、抗U1RNP-A抗体有关联，而与抗U1RNP-70K、抗U2RNP抗体、抗SmRNP抗体不相关。3、抗HPA31抗体同抗HPA90抗体具有交叉反应性，但两者均不能识别U1RNP-B’／B、U1RNP-A及U1RNP-70K抗原。抗HPAEC抗体同抗U1RNP抗体结构上无关联。4、HPA31抗原和HPA90抗原位于HPAEC的表面。5、抗HPAEC抗体可通过与细胞表面的抗原结合，促进HPAEC分泌RANTES。6、RANTES的产生和分泌增多可能是抗HPAEC抗体诱导肺血管内皮损伤的机制之一。