背景与目的大量研究表明,人类生命早期应激(Early Life Stress, ELS),对成年后学习记忆和情绪能力产生影响,增加精神疾病发病率和社会犯罪率。但其生物学机制尚不清楚,目前的研究主要采用动物模型,集中在神经内分泌系统。应用于啮齿类动物的母爱剥夺(Maternal Deprivation,MD)模型,因其符合人类生命早期母子分离的特征,得到了广泛应用。本课题组的前期研究表明,生命早期母爱剥夺可致大鼠成年后的学习记忆和行为异常,生命早期母爱剥夺大鼠成年后海马神经元数量减少、神经元细胞凋亡增多,海马神经损伤可能是导致认知情绪障碍的原因之一。中枢炎性细胞因子IL-1β在接受各种应激后含量显著增多,与神经损伤关系密切。我们认为,人类生命早期应激是多种精神和躯体疾病的重要风险因素,而中枢IL-1β导致的海马神经损伤,可能是生命早期应激引起精神疾病(尤其是抑郁症)发病的重要神经生物学机制之一。BDNF和CREB都与认知情绪障碍有关,且BDNF是CREB的下游目标基因,CREB与海马神经再生关系密切,BDNF对神经元有营养及保护作用,有研究表明,腹腔注射LPS或脑室注射IL-1β可以引起BDNF和CREB的变化。因此,本研究拟在前期研究的基础上,进一步探讨生命早期应激海马神经损伤的IL-1β机制。以大鼠母爱剥夺建立人类生命早期应激动物模型,检测母爱剥夺大鼠海马IL-1β的改变,并通过腹腔注射LPS刺激中枢IL-1β的释放,从P-CREB、BDNF机制入手,探讨IL-1β与海马神经损伤和再生的关系,并分析可能神经生物学机制,为早期干预提供科学依据。材料与方法1、母爱剥夺模型健康、性成熟清洁级Sprague-Dawley大鼠,体重200-250g,雌雄各1只同笼饲养,待其繁殖,新生雄性大鼠用于实验研究。母爱剥夺模型分为两个阶段:①母婴分离阶段:从大鼠出生后第3天至21天,每日母婴分离3小时;②隔离饲养阶段:经历过母婴分离的大鼠自第22天断奶后单笼饲养至第60天。分别在每一阶段末(即22日龄和61日龄)乙醚麻醉后,将大鼠断头取脑,检测P-CREB、IL-1β和BDNF的改变。2、LPS腹腔注射健康、雄性性成熟清洁级Sprague-Dawley大鼠,体重200-250g,共20只,分为LPS组和NS组,腹腔注射LPS 225ug/kg一周,隔天一次,对照组腹腔注射等量生理盐水,第八天乙醚麻醉后冰上断头取脑,检测LPS对海马IL-1β、P-CREB和BDNF的作用,验证海马IL-1β的神经损伤机制。3、P-CREB、IL-1β和BDNF检测海马P-CREB的检测采用免疫组化方法、IL-1β和BDNF以ELLISA法测定,海马神经元再生采用Brdu免疫组化测定。4、统计分析实验数据应用EXCEL 2003和SPSS13.0统计学软件进行统计分析。符合正态分布的数据应用均数±标准差(x±S)表示,进行两独立样本的t检验;若数据不符合正态分布则应用中位数(四分位数间距)[M(QR)]表示,进行两独立样本的非参数检验。以P<0.05为差别有显著性。结果1、生命早期母爱剥夺对大鼠海马IL-1β、P-CREB和BDNF含量的影响母爱剥夺组大鼠于出生后的第3-21天和第22-60天分别接受母婴分离和隔离饲养应激,对照组正常饲养,分别在22和61日龄处死大鼠取脑,检测母爱剥夺对大鼠海马IL-1β、P-CREB和BDNF的作用。1.1生命早期母爱剥夺对不同鼠龄大鼠海马IL-1β的影响分别在22日和61日鼠龄时处死大鼠取脑分离海马,匀浆后酶联免疫吸附试验检测大鼠海马IL-1β水平。结果显示,22日龄时,对照组与母爱剥夺组大鼠海马组织中IL-1β水平分别是2.4400±0.2660和3.4067±0.4255。与对照组相比,母爱剥夺组大鼠海马IL-1β水平显著升高,结果表明经过母婴分离应激后,22日龄大鼠海马组织中IL-1β水平升高。61日龄龄时,对照组与母爱剥夺组大鼠海马组织中IL-1β水平分别是1.6817±0.3159和2.1596±1.0145。两组相比,大鼠海马IL-1β水平无显著变化,表明母爱剥夺应激对61日龄大鼠海马IL-1β水平无显著影响。1.2生命早期母爱剥夺对不同鼠龄大鼠海马P-CREB的影响以石蜡切片免疫组织化学方法计数海马P-CREB水平。结果显示,大鼠22日龄时,对照组与母爱剥夺组大鼠海马组织中P-CREB的相对阳性细胞数分别为19.50±5.468和12.67±2.338,与对照组相比,母爱剥夺组大鼠海马P-CREB数量显著减少;大鼠61日龄时,母爱剥夺组大鼠海马P-CREB数量无显著变化。结果表明,生命早期母婴分离应激可致海马P-CREB减少,但随着鼠龄的增加,这种影响逐渐减弱。1.3生命早期母爱剥夺对海马BDNF的作用分别在22日和61日鼠龄时处死大鼠取脑分离海马,匀浆后酶联免疫吸附试验检测大鼠海马BDNF水平。结果显示,22日龄时,对照组与母爱剥夺组大鼠海马组织中BDNF水平分别为9.5263±1.7286和6.4415±2.4640,与对照组相比,在大鼠22日龄时,母爱剥夺组大鼠海马BDNF水平显著降低;61日龄时,对照组与母爱剥夺组大鼠海马组织中BDNF水平分别为5.1076±1.0264和4.6960±1.0376,母爱剥夺组大鼠海马BDNF水平无显著变化,结果表明,生命早期母婴分离应激可致海马BDNF水平减少,但随着鼠龄的增加,这种影响逐渐减弱。2、腹腔注射LPS对海马IL-1β、P-CREB和BDNF含量的影响健康雄性成年SD大鼠腹腔注射LPS,隔天一次,连续一周(225ug/kg)。对照组腹腔注射等量生理盐水,第八天乙醚麻醉后冰上断头取脑,检测LPS对海马IL-1β、P-CREB和BDNF的作用。2.1腹腔注射LPS对海马IL-1β的作用处死大鼠取脑分离海马,匀浆后酶联免疫吸附试验检测大鼠海马IL-1β水平。结果显示,LPS腹腔注射组与生理盐水组大鼠海马组织中IL-1β水平分别是2.0440±0.3760和1.3805±0.6032。与生理盐水组相比,腹腔注射LPS组大鼠海马IL-1β水平显著升高,结果表明,经过腹腔注射LPS后,大鼠海马IL-1β水平升高。2.2腹腔注射LPS对海马P-CREB的作用石蜡切片免疫组织化学方法计数海马P-CREB水平。结果显示,生理盐水组与LPS组大鼠海马组织中P-CREB相对阳性细胞数分别是14.50±1.871和12.00±1.732,与生理盐水组相比,腹腔注射LPS组大鼠海马P-CREB数量显著减少;结果表明,经过腹腔注射LPS后,大鼠海马P-CREB数量减少。2.3腹腔注射LPS对海马BDNF的作用处死大鼠取脑分离海马,匀浆后酶联免疫吸附试验检测大鼠海马BDNF水平。结果显示,生理盐水组与LPS组大鼠海马组织中BDNF水平分别是5.7730±1.732和6.0432±1.6881与生理盐水组相比,腹腔注射LPS组大鼠海马BDNF水平无显著变化,结果表明,经过腹腔注射LPS后,大鼠海马BDNF无显著变化。结论神经损伤是生命早期母爱剥夺导致成年后行为异常的原因之一,而海马IL-1β水平升高可能是海马神经损伤的机制之一。CREB和BDNF可能介导了IL-1β所致的生命早期母爱剥夺大鼠的神经损伤过程。