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现有的高产水稻品种大多具有光能利用效率高（优秀株型）、分蘖能力强、植株生物量大、持续灌浆周期长等特点，其高产潜力的发挥在很大程度上依赖于氮素等养分的充足供应。尤其是在生育后期，需要较高的叶片氮浓度来维持功能叶的光合作用效率和光合功能期以满足籽粒灌浆对光合同化产物的需求。因此水稻生产上通常施用大量甚至过量的氮肥来保证这一需求。由于稻田土壤在生育期的大部分时间里处于淹水、厌氧状态，不利于硝化作用的进行，施入的大量氮肥长期以铵态氮的形式存在于土壤中。已有众多研究表明，高浓度的铵在土壤中会抑制根系的生长，影响根系供应养分和水分的能力;在植株内部过量铵的积累则会诱发胁迫防御反应，造成大量能量的消耗和碳水化合物合成力的降低，进而抑制植株的生长发育。因此，高产水稻对氮素的依赖性与超过其同化消纳能力的铵积累所带来的负面效应之间已形成不可忽视的矛盾。研究高氮肥投入下水稻氮素高效利用的调控机制就显得尤为必要。本文在此背景下，借助拟南芥铵吸收基因(AMT)和铵同化基因(GS)突变体，通过水培和土培试验，比较不同铵供应强度下野生型(WT)及突变体在铵吸收、同化以及碳氮代谢关键酶活的差异，利用铵同化基因OsGS1;2的超表达水稻株系通过水培模拟试验和高施氮情景(300kg N/hm2)的田间试验验证了其生物学和农学效果。
本文所取得的研究结果总结如下:
(1)低铵(0.1mM)处理下amt1.1和amt1.3突变体的生物量显著低于WT;同时植株含N量均比WT分别降低了40.8％和49.8％。而在高铵供应下(10mM)，植物生长受到抑制，游离铵在植株中显著积累。因为AMT基因的突变，amt1.1和amt1.3突变体中游离铵含量分别比WT低24.1％和23.8％。含N量比WT分别降低了25.2％和22.6％，所受的高铵毒害弱于WT。由此推断，AMT是拟南芥吸收铵的主要系统，在供铵不足时更能发挥AMT的铵吸收能力;而在高铵情况下AMT的功能有所减弱，但仍可进行铵的吸收，导致植株铵的积累和生长的抑制现象。
(2)GS是铵同化的关键酶和限速酶。低铵(0.1mM)处理下，GS活性最低，随着供铵浓度的增加(0.1/1/10mM)，WT和AMT突变体植株的GS活性均有增加，但酶活的增强幅度与供铵浓度的增幅并不匹配。GDH是连接植物碳氮代谢的关键酶。低铵(0.1mM)处理下，GDH活性最低;在1mM铵时GDH活性达到最高，随着供铵浓度升高至10mM，其活性又趋于降低，此时amt1.1和amt1.3突变体的GDH酶活均高于WT，幅度分别为10.4％和15.9％。AMT突变体和WT植株中GS和GDH酶活随供铵状况（不足或过量）的变化规律可能暗示了GS途径是铵同化的限速步骤，其活性在适度供铵时受到诱导，发挥其最佳的铵同化能力，当过量供铵超过GS-GDH同化和转移能力的时候，导致铵同化产物不能有效转移进而限制了GS的同化能力。高铵下AMT基因的缺失减少了游离铵含量，使得GS-GDH路径比WT相对畅通一些。因此高铵下GS主导的铵同化能力不足是导致游离铵积累的进一步原因。
(3)由于GS催化的铵同化作用需要谷氨酸提供碳骨架，高铵下GS同化力的不足可能与碳骨架有关。叶面连续喷施1％蔗糖显著提高了高铵(10mM)下GS和GDH酶的活性，增强对植株游离铵的同化能力，缓解了高铵对生长的抑制。这一结果为高铵下同化力不足的原因提供了进一步佐证（碳源不足）。
(4)高铵处理下，gs1.1和gs1.2突变体植株游离铵含量显著高于WT（分别增加25％和39％），而植株N含量却比WT低约20％，表明GS突变体所摄入的铵更大程度上以游离铵的形式滞留在植株体内，不能被有效转化为复杂同化产物。高铵下GS突变体生长受到抑制更为明显，生物量比WT低约30％（处理周期内）。在所有供铵条件下，突变体的GS酶活性均显著低于WT，但尚可保留约80％的酶活，表明GS1;1和GS1;2的基因产物只是拟南芥中总GS酶活性的一部分，且各自发挥大约20％总活性的作用。与GS相反，gs1.1和gs1.2突变体的GDH活性均显著高于WT约20％，可能暗示当铵同化的限速步骤GS途径受到抑制时，同化产物不再“拥堵”而得以顺利经由GDH途径进入碳氮代谢过程。叶面喷施蔗糖(1％)可减轻高铵对植株的毒害作用，WT、gs1.1和gs1.2突变体的生物量分别增加了5.1％、14.7％和9.6％;GS酶活性分别增加了13.4％、17.1％和23.3％;GDH酶活性分别增加15.5％，19.0％和19.7％;与此同时游离铵含量则分别降低了12.4％，22.0％和23.6％。可见外源增补碳源对GS突变体的游离铵消纳效果更为明显。
(5)弱光下（遮光50％），高铵反而表现出促进拟南芥生长的现象，而GS突变体的生长优势更为明显。与正常供铵/遮光相比，WT、gs1.1和gs1.2的生物量在高铵20mM/遮光下分别增加30.4％、75.2％和72.8％。这种条件下，gs1.1和gs1.2突变体植株中的游离铵的总体水平低于正常铵/正常光照下游离铵的水平，表明光照不足从高铵毒害的源头上显著降低了游离铵的积累。遮光处理也降低了高铵对植株含N量的贡献，WT、gs1.1和gs1.2的含N量分别降低了42.7％、25.4％和22.2％（与正常光照相比）。GS和GDH酶的活性遮光时候受到抑制，但是在突变体和WT中的变化仍与正常光照下的规律相似，即gs1.1和gs1.2突变体中GDH的活性分别比WT高27％和25％。上述结果表明，光照不足的情况下限制拟南芥铵态氮利用效率的关键因素可能是氮素摄入量的不足，此时GS催化的铵同化过程不再是限速步骤。
以上实验结果都为水培试验结果。土培试验与水培相同条件同步进行，所得结果和趋势类似。
(6)水培试验结果表明，在高铵(10mM)条件下，三个OsGS1;2超表达株系（G2-1，G2-2和G2-4）的地上部的生物量分别高于WT11.9％，15.9％和11.0％，N积累量分别增加了15.9％，26.6％和14.4％。超表达株系的生物学表现与其体内OsGS1;2的表达丰度有关。
(7)田间试验结果表明，OsGS1;2超表达株系具有较强的分蘖能力。生育后期功能叶可维持较高的N浓度，剑叶含N量比WT分别增加了17.6％，19.5％和18.4％;同时剑叶持绿时间长，叶绿素含量分别高于WT24.3％，11.5％和16.2％。这些特征大幅度提高了籽粒灌浆盛期的光合速率（分别较WT提高41.9％，90.1％和52.8％）。OsGS1;2基因超表达丰度最高的G2-2的单株籽粒产量和饱满粒重量显著高于WT，增产幅度达14.5％。这些结果说明，在田间高氮情景下通过分子调控铵同化基因OsGS1;2的活性能够促进水稻生长并增加籽粒产量。因此可作为提高高氮素投入下水稻氮素利用率的潜在的调控途径。
综上所述，本文的研究结果初步明确了高铵抑制植物生长的关键原因是体内铵同化能力的不足而导致植株游离铵的积累。补充碳源是消减高铵毒害作用的有效调控手段。在高水平氮素投入下超表达铵同化基因OsGS1;2可进一步提高水稻对氮素的利用效率及其农学效应。
本文所取得的研究结果总结如下:
(1)低铵(0.1mM)处理下amt1.1和amt1.3突变体的生物量显著低于WT;同时植株含N量均比WT分别降低了40.8％和49.8％。而在高铵供应下(10mM)，植物生长受到抑制，游离铵在植株中显著积累。因为AMT基因的突变，amt1.1和amt1.3突变体中游离铵含量分别比WT低24.1％和23.8％。含N量比WT分别降低了25.2％和22.6％，所受的高铵毒害弱于WT。由此推断，AMT是拟南芥吸收铵的主要系统，在供铵不足时更能发挥AMT的铵吸收能力;而在高铵情况下AMT的功能有所减弱，但仍可进行铵的吸收，导致植株铵的积累和生长的抑制现象。
(2)GS是铵同化的关键酶和限速酶。低铵(0.1mM)处理下，GS活性最低，随着供铵浓度的增加(0.1/1/10mM)，WT和AMT突变体植株的GS活性均有增加，但酶活的增强幅度与供铵浓度的增幅并不匹配。GDH是连接植物碳氮代谢的关键酶。低铵(0.1mM)处理下，GDH活性最低;在1mM铵时GDH活性达到最高，随着供铵浓度升高至10mM，其活性又趋于降低，此时amt1.1和amt1.3突变体的GDH酶活均高于WT，幅度分别为10.4％和15.9％。AMT突变体和WT植株中GS和GDH酶活随供铵状况（不足或过量）的变化规律可能暗示了GS途径是铵同化的限速步骤，其活性在适度供铵时受到诱导，发挥其最佳的铵同化能力，当过量供铵超过GS-GDH同化和转移能力的时候，导致铵同化产物不能有效转移进而限制了GS的同化能力。高铵下AMT基因的缺失减少了游离铵含量，使得GS-GDH路径比WT相对畅通一些。因此高铵下GS主导的铵同化能力不足是导致游离铵积累的进一步原因。
(3)由于GS催化的铵同化作用需要谷氨酸提供碳骨架，高铵下GS同化力的不足可能与碳骨架有关。叶面连续喷施1％蔗糖显著提高了高铵(10mM)下GS和GDH酶的活性，增强对植株游离铵的同化能力，缓解了高铵对生长的抑制。这一结果为高铵下同化力不足的原因提供了进一步佐证（碳源不足）。
(4)高铵处理下，gs1.1和gs1.2突变体植株游离铵含量显著高于WT（分别增加25％和39％），而植株N含量却比WT低约20％，表明GS突变体所摄入的铵更大程度上以游离铵的形式滞留在植株体内，不能被有效转化为复杂同化产物。高铵下GS突变体生长受到抑制更为明显，生物量比WT低约30％（处理周期内）。在所有供铵条件下，突变体的GS酶活性均显著低于WT，但尚可保留约80％的酶活，表明GS1;1和GS1;2的基因产物只是拟南芥中总GS酶活性的一部分，且各自发挥大约20％总活性的作用。与GS相反，gs1.1和gs1.2突变体的GDH活性均显著高于WT约20％，可能暗示当铵同化的限速步骤GS途径受到抑制时，同化产物不再“拥堵”而得以顺利经由GDH途径进入碳氮代谢过程。叶面喷施蔗糖(1％)可减轻高铵对植株的毒害作用，WT、gs1.1和gs1.2突变体的生物量分别增加了5.1％、14.7％和9.6％;GS酶活性分别增加了13.4％、17.1％和23.3％;GDH酶活性分别增加15.5％，19.0％和19.7％;与此同时游离铵含量则分别降低了12.4％，22.0％和23.6％。可见外源增补碳源对GS突变体的游离铵消纳效果更为明显。
(5)弱光下（遮光50％），高铵反而表现出促进拟南芥生长的现象，而GS突变体的生长优势更为明显。与正常供铵/遮光相比，WT、gs1.1和gs1.2的生物量在高铵20mM/遮光下分别增加30.4％、75.2％和72.8％。这种条件下，gs1.1和gs1.2突变体植株中的游离铵的总体水平低于正常铵/正常光照下游离铵的水平，表明光照不足从高铵毒害的源头上显著降低了游离铵的积累。遮光处理也降低了高铵对植株含N量的贡献，WT、gs1.1和gs1.2的含N量分别降低了42.7％、25.4％和22.2％（与正常光照相比）。GS和GDH酶的活性遮光时候受到抑制，但是在突变体和WT中的变化仍与正常光照下的规律相似，即gs1.1和gs1.2突变体中GDH的活性分别比WT高27％和25％。上述结果表明，光照不足的情况下限制拟南芥铵态氮利用效率的关键因素可能是氮素摄入量的不足，此时GS催化的铵同化过程不再是限速步骤。
以上实验结果都为水培试验结果。土培试验与水培相同条件同步进行，所得结果和趋势类似。
(6)水培试验结果表明，在高铵(10mM)条件下，三个OsGS1;2超表达株系（G2-1，G2-2和G2-4）的地上部的生物量分别高于WT11.9％，15.9％和11.0％，N积累量分别增加了15.9％，26.6％和14.4％。超表达株系的生物学表现与其体内OsGS1;2的表达丰度有关。
(7)田间试验结果表明，OsGS1;2超表达株系具有较强的分蘖能力。生育后期功能叶可维持较高的N浓度，剑叶含N量比WT分别增加了17.6％，19.5％和18.4％;同时剑叶持绿时间长，叶绿素含量分别高于WT24.3％，11.5％和16.2％。这些特征大幅度提高了籽粒灌浆盛期的光合速率（分别较WT提高41.9％，90.1％和52.8％）。OsGS1;2基因超表达丰度最高的G2-2的单株籽粒产量和饱满粒重量显著高于WT，增产幅度达14.5％。这些结果说明，在田间高氮情景下通过分子调控铵同化基因OsGS1;2的活性能够促进水稻生长并增加籽粒产量。因此可作为提高高氮素投入下水稻氮素利用率的潜在的调控途径。
综上所述，本文的研究结果初步明确了高铵抑制植物生长的关键原因是体内铵同化能力的不足而导致植株游离铵的积累。补充碳源是消减高铵毒害作用的有效调控手段。在高水平氮素投入下超表达铵同化基因OsGS1;2可进一步提高水稻对氮素的利用效率及其农学效应。