microRNA (miRNA)是一类由基因组编码的长度为18-26个核苷酸的单链非编码小RNA,它们广泛存在于真核细胞中,在进化上高度保守。在RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ的作用下,miRNA以前体的形式从基因组中转录出来。它的形成过程涉及一系列蛋白分子对其转录前体的剪切和转运,最终成熟的miRNA在细胞质中与其它相关蛋白分子一起构成沉默复合体(RISC),通过与靶mRNA分子的3’UTR中相应序列的结合,导致靶mRNA的降解或者转录后翻译受到抑制。到目前为止,已在生物体内发现上万种的miRNA,它们构成了一个复杂的调控网络,参与细胞增殖分化、生物体发育、机体免疫应答和肿瘤发生等生理及病理过程。当病原微生物入侵时,机体的先天性免疫应答会被迅速激活,并通过其介导的炎症和抗病毒反应来杀灭和清除病原微生物。NF-κB是先天性免疫应答过程中的一个重要信号通路,当它被激活时,能够启动下游一系列细胞因子的转录,从而促进机体的炎症反应的发生,与此同时先天性免疫应答诱导产生的Ⅰ型干扰素在机体的抗病毒反应中也发挥了重要作用。宿主的抗感染先天性免疫应答一方面要产生足够强烈的炎症反应以彻底消灭入侵的病原微生物,另一方面又要防止这一反应的过度激活而对机体本身带来的损伤。在这一信号转导过程中,存在着许多正负调控因子,以保障机体先天性免疫应答的适度激活。越来越多的文献报道miRNA参与了先天性免疫应答,并发挥重要的调控作用。发现和鉴定参与调控先天性免疫应答的miRNA及对其分子机制的研究,可以加深对宿主先天性免疫应答调控的理解,为研制抗感染药物提供新的靶标。在本课题中,我们初步鉴定出了38种可能调控先天性免疫应答信号通路的miRNA,并对其中的miR-526a、miR-617和miR-623进行了进一步的功能研究。1高通量筛选参与先天性免疫应答的miRNA:通过IFNβ和IL-1p(NF-κB调控的细胞因子)的检测平台,对140个miRNA进行筛选,从中鉴定出了38种参与先天性免疫应答的功能miRNA。其中21种能够上调IFNβ的表达水平,22种能够上调IL-1p的表达水平。2miR-526a在先天性免疫应答中功能的初步研究：通过荧光素酶报告基因和酶联免疫吸附试验发现,miR-526a能够明显上调IFNp和IL-1p的表达水平。因此,我们进一步研究了miR-526a在宿主先天性免疫应答中的作用。通过荧光定量PCR的方法,我们发现在VSV和LPS诱导THP-1细胞的过程中,miR-526a的表达水平随着时间的变化逐渐增强,这说明miR-526a可能参与了病原体感染的宿主免疫应答。接下来,通过生物信息学的方法预测到CYLD可能是miR-526a的靶点。通过荧光定量PCR的方法,我们发现细胞中过表达miR-526a能够在转录和翻译水平上抑制CYLD的表达。CYLD是一个去泛素化酶,能够通过对RIG-I的去泛素化作用抑制RIG-I的信号转导；同时它还能够通过与MyD88的相互作用抑制其对下游分子的磷酸化进而负调控TLR4信号通路,从而下调宿主先天性免疫应答水平。上述结果初步证明miR-526a可能通过负调控CYLD的表达水平促进IFNp和IL-1β的产生。3参与炎症反应的miR-617和miR-623在肿瘤发生中功能的初步研究：通过酶联免疫吸附试验发现,miR-617和miR-623能够明显上调IL-1β的表达水平,而IL-1p是受NF-κB调控的最重要的细胞因子之一。NF-κB信号通路在先天性免疫促炎症反应中发挥着重要的作用。大量研究表明,在肿瘤的发生过程中,常伴有NF-κB信号通路特征性的表达变化,其中炎症相关分子参与了肿瘤的发生,并在肿瘤形成的不同阶段起着决定性的作用。IL-1p是一个前炎症因子,它介导的炎症反应所产生的微环境能够导致正常细胞突变同时促进细胞的增殖。其它相关课题的研究中发现,miR-617和miR-623在乳腺癌发生过程中表达增高,因此我们探讨了miR-617和miR-623在乳腺癌发生中的作用。通过细胞计数和划痕实验,我们发现在乳腺癌细胞系ZR-75-1中过表达miR-617和miR-623能够导致肿瘤细胞增殖和迁移能力的显著增加。上述结果表明miR-617和miR-623可能通过影响细胞的炎症反应参与肿瘤的发生,为我们进一步研究miR-617和miR-623的功能打下了基础。综上所述,本课题初步鉴定了38种可能参与先天性免疫应答的miRNA,进一步研究表明,miR-526a可能通过抑制负调控因子CYLD从而上调IFNβ和IL-1β的表达水平；此外参与炎症反应的miR-617和miR-623能够促进肿瘤的生长与转移。这些研究为进一步揭示miRNA在先天性免疫应答及炎症介导的肿瘤发生中的分子机制提供了重要线索。