多杀性巴氏杆菌是畜禽养殖业中的重要病原菌,在鸭上引起的禽霍乱死亡率极高,造成的经济损失巨大。现阶段,控制该病最主要的方式是使用抗菌药。氟苯尼考为动物专用的酰胺醇类抗菌药,具有抗菌谱广,抗菌活性强,药动学特征优良,无再生障碍性贫血不良反应等特点,在畜禽养殖业中发挥着重要的作用。目前,关于氟苯尼考对多杀性巴氏杆菌的PK/PD模型研究已有报道,但是仅仅局限于体外以及半体内PK/PD同步模型,其结果没有考虑到细菌在体内的复制传播过程以及机体免疫对细菌的清除作用,得出的给药方案往往不能起到良好的指导作用。因此,本课题开展了氟苯尼考在多杀性巴氏杆菌感染鸭的体内PK/PD同步模型研究,以期获得氟苯尼考对多杀性巴氏杆菌的体内PK/PD参数,为制定氟苯尼考的合理给药方案,加强药物治疗效果,并减少耐药菌株产生提供试验依据;同时,将PK/PD同步模型与蒙特卡罗分析有机地结合起来,从而制定合理的群体给药方案并建立氟苯尼考对多杀性巴氏杆菌的PK/PD折点,为多杀性巴氏杆菌的耐药监控提供科学的判定依据。1.禽源多杀性巴氏杆菌的体外药效学研究采用微量稀释法测定的氟苯尼考对12株禽源多杀性巴氏杆菌的MIC范围在0.125-32μg/mL(肉汤)和0.25-32 μg/mL(鸭血清)之间,头孢喹肟、庆大霉素、替米考星和恩诺沙星对被测菌的 MIC 范围分别在 0.25-128 μg/mL、4-8 μg/mL、1-128 μg/mL 和 0.25-2 μg/mL之间,菌株对头孢喹肟、氟苯尼考和替米考星的敏感率最高(92%),庆大霉素次之(75%),对恩诺沙星的敏感率最低,仅为33%。氟苯尼考对12株禽源多杀性巴氏杆菌的MBC和MPC 范围分别为 0.25-64 μg/mL 和0.2-64 μg/mL,MBC 等于 2 倍 MIC,MPC 等于 1.6～2倍MIC;体外杀菌曲线表明,当初始菌量为106CFU/mL时,2倍MIC可以达到杀菌效果,而当初始菌量为108CFU/mL时,4倍MIC才可以达到杀菌效果。2.多杀性巴氏杆菌鸭感染模型的建立通过对六周龄的高邮鸭气管攻毒200 μL浓度为102 CFU/mL的多杀性巴氏杆菌菌悬液,12 h后能够出现典型的临床症状和病理变化,并且肝脏和肺脏的载菌量稳定在106～107 CFU/liver 或 CFU/lung,均一性良好。3.氟苯尼考在健康和多杀性巴氏杆菌感染鸭的体内药动学研究将168只多杀性巴氏杆菌感染鸭随机分为四组,1～3组每组52只,分别口服1、15和30 mg/kgb.w.的氟苯尼考,在不同时间点采集血清和肺组织,第4组12只,口服60 mg/kg b.w.的氟苯尼考,在不同时间点采集血清;选取52只健康鸭口服临床推荐给药剂量30 mg/kg b.w.的氟苯尼考并在不同时间点采集血清和肺组织。采用高效液相色谱(HPLC)法测定药物浓度,通过WinNonlin软件分析氟苯尼考在健康和感染鸭血清和肺组织中的药动学参数,并比较临床推荐给药剂量下氟苯尼考在健康和多杀性巴氏杆菌感染鸭的药动学差异。采用平衡透析法测定氟苯尼考在多杀性巴氏杆菌感染鸭血清中的蛋白结合率。药动学结果显示,氟苯尼考在1～60 mg/kgb.w.(血清)和1～30 mg/kgb.w.(肺组织)的剂量范围内,Cmax和AUC0-24h与剂量呈现良好的线性关系。氟苯尼考在健康鸭和多杀性巴氏杆菌感染鸭的药动学特征差异明显,在血清药动学中,感染鸭能达到的最大血药浓度比健康鸭低(Cmax:13.88±2.70vs.17.86±1.57μg/mL),而两者之间的 MRT(2.35±0.13 vs.2.27 士 0.18 h)和 T1/2β(1.72±0.22 vs.1.62 士 0.07 h)很相似,因而健康鸭的 AUC0-12h 比感染鸭大(49.47±5.31 vs.34.52±8.29 μg.h/mL);健康鸭和感染鸭肺组织药动学的趋势和血清药动学一致;无论是健康鸭还是多杀性巴氏杆菌感染鸭,氟苯尼考在肺组织中的药物浓度大约是血清中的1.2倍。氟苯尼考在多杀性巴氏杆菌感染鸭血清中的蛋白结合率约为 10%。4.氟苯尼考在多杀性巴氏杆菌感染鸭的体内药效学研究,PK/PD拟合及给药剂量的推导选取135只健康六周龄高邮鸭,随机分成三组,每组45只,分别感染0825Y1(对五种抗菌药均表现敏感),0901J1(对庆大霉素和恩诺沙星呈现中介和耐药但对氟苯尼考表现敏感),JY160110(对头孢喹肟、氟苯尼考、替米考星呈现耐药且对恩诺沙星呈现中介)。将各组感染的45只动物随机分成9组,分别口服生理盐水、1、2、5、8、10、15、20和30mg/kgb.w.的氟苯尼考,一天给药两次,连续给药三天,在最后一次给药12h后将动物处死,无菌采取一侧肺脏和肝脏,通过平板菌落计数法计算脏器中的载菌量,利用WinNonlin软件中的Sigmoid Emax模型,将脏器载菌量变化值与PK/PD参数Cmax/MIC和AUC0-24h/MIC进行拟合,计算达到抑菌和杀菌作用所需要的PK/PD参数值,并推导达到杀菌效果所需的给药剂量。氟苯尼考对三株细菌的体内药效结果表明,随着给药剂量的增加,体内抗菌效果随之增强,PK/PD相关参数Cmax/MIC和AUC0-24h/MIC与细菌的变化量之间拟合度良好,相关系数在 0.9 左右。对于敏感菌 0825Y1,AUC0-24h/MIC 为 117.54 和 108.19,Cmax/MIC 为 23.76和21.61时,氟苯尼考在肝脏和肺脏中达到杀菌效果;对于庆大霉素和恩诺沙星呈现中介和耐药但对氟苯尼考敏感的菌株0901J1,AUC0-24h/MIC为78.39和54.30,Cmax/MIC为15.62和10.70时,在肝脏和肺脏中能够达到杀菌效果;而对于耐药菌JY160110,AUC0-24h/MIC的值为2.03和2.06,Cmax/MIC为0.42时,可使药物在肝脏和肺脏中达到细菌减少1-Log10的效果,氟苯尼考对耐药菌无法达到杀菌效果。结果表明,以不同脏器作为药效靶标,达到相同的抗菌效果所需要的PK/PD参数值存在一定差异;而以不同菌株为研究对象,达到相同抗菌效果所需的PK/PD参数值有较大差异。对于0825Y1和0901J1这两株敏感菌株,达到杀菌效果所需的日剂量为41 mg/kgb.w.,而对于JY160110耐药菌株,细菌数量减少1-Logio所需的日剂量为64 mg/kg b.w.。5.蒙特卡罗模拟预测群体给药剂量和分析PK/PD折点(COPD)从NCBI数据库中收集了氟苯尼考对4314株分离自多个国家和地区的多杀性巴氏杆菌的MIC数据,作全球、中国大陆地区以及台湾地区(耐药严重)的MIC概率分布图。在这些MIC分布下,通过蒙特卡罗模拟计算在临床推荐给药日剂量下的达标率(TAR),不同地区达到50%TAR、90%TAR(或85%TAR)所需要的群体给药日剂量,氟苯尼考对多杀性巴氏杆菌的PK/PD折点。现有的临床推荐给药日剂量下,中国大陆地区及全球范围的达标率分别在85.98%和66.84%以上;中国台湾地区的达标率在30.09%以上。在中国大陆地区,达到50%TAR和90%TAR目标临界值(敏感菌株)所需的群体给药日剂量分别为21和52 mg/kgb.w.;在全球范围,达到50%TAR和85%TAR目标临界值(敏感菌株)所需的群体给药日剂量分别为33和90mg/kgb.w.;在中国台湾地区,达到50%TAR目标临界值(耐药菌株)所需的群体给药日剂量为84 mg/kgb.w.。已有氟苯尼考临床推荐给药剂量(40和60 mg/kgb.w.)以及本研究推荐的适用于中国大陆地区和全球范围的给药剂量(52和90 mg/kgb.w.)下,分析得到氟苯尼考对多杀性巴氏杆菌的PK/PD折点分别为0.25 μg/mL、4 μg/mL、0.5 μg/mL和 4 μg/mL。