木材是重要可再生资源,其形成依赖于树木的次生木质部发育。次生木质部由位于树木茎中呈环状分布的一类侧向干细胞——维管形成层向内分裂分化而来。前人的研究表明,形成层持续的分裂分化活性是决定木材发育的关键因素,然而,其分子调控机制目前仍不太清楚。因此,形成层干细胞活性维持的调控机制是林木生物学研究中亟待解决的重要科学问题。已经知道,植物激素、小肽信号和一系列转录因子均参与调控植物的次生生长。由韧皮部特异性表达基因CLE41/44编码的可移动小肽TRACHEARY ELEMENT DIFFERENTIATION INHIBITORY FACTOR（TDIF）,被形成层区域的受体激酶TRACHEARY ELEMENT DIFFERENTIATION INHIBITORY FACTOR/PHLOEM INTERCALATED WITH XYLEM（TDR/PXY）受体所感知,促进WOX4转录因子的表达以维持形成层干细胞活性。生长素（Auxin）和赤霉素（Gibberellin,GA）作为两种关键激素,影响从形成层活性维持到木质部分化的整个次生生长过程。生长素主要分布在维管形成层区域,其缺失或者抑制其信号转导均导致形成层活性明显降低。赤霉素主要分布于发育的木质部,改变GA的水平或信号转导影响形成层干细胞活性稳态。同时使用生长素和赤霉素处理较使用单一激素处理产生更宽的形成层区域和更多的木质部细胞,表明生长素和赤霉素能够协同调控茎干的次生生长,但是其分子机制尚未可知。生长素和赤霉素的信号转导通路在植物中已有大量报道。GA诱导受体GID1发生蛋白构象改变与DELLA蛋白互作,致使DELLA蛋白发生泛素化,被26S蛋白酶体降解。DELLA蛋白通过与其他转录因子互作,实现对GA响应基因的转录调控。生长素响应因子Auxin Response Factor（ARF）作为核心直接连接生长素信号和下游基因的转录调控。DELLA蛋白和ARF转录因子是否直接参与形成层活性的调控,目前尚不明确。针对以上问题,本研究以毛白杨（Populus tomentosa）为材料,通过切片分析杨树维管形成层活性、蛋白互作筛选与验证、转录组分析及下游靶基因验证,解析了GA和生长素协同调控形成层活性的分子机制。主要研究结果如下:1)GA调控杨树形成层活性及木材形成为精确表征GA在树干次生生长过程中的作用,分别在发育中的木质部组织特异性表达活性GA合成酶GA3ox或钝化酶GA2ox,上调或下调内源活性GA的含量。通过切片分析,统计木质部层数及占比,发现GA促进次生木质部发育。对形成层层数及垂周分裂发生频率进行统计分析发现,GA促进了形成层细胞分裂,从而影响形成层干细胞活性。2)GA通过其本地信号转导促进形成层活性为进一步研究GA调控形成层活性的分子机制,对GA受体GID1和关键阻遏因子DELLA在形成层区域的表达情况分析表明,在维管形成层区域存在完整的GA信号转导通路,并推测DELLA蛋白RGL1可能参与形成层活性调控。蛋白互作分析表明GID1和DELLA能够发生互作。使用GA处理融合GFP荧光蛋白标签的DELLA烟草瞬时转化株系,荧光数量和荧光强度均呈现明显减少/减弱,表明杨树DELLA蛋白的稳定性受到GA的负向调控,这与模式植物拟南芥中的报道是一致的。突变RGL1的DELLA结构域,发现能够抑制GA对RGL1的降解。据此构建形成层特异性阻断GA信号的转基因株系,发现其形成层活性受到明显抑制,表明GA通过在形成层区域的本地信号转导促进形成层活性。3)GA和Auxin通过其信号转导通路的互作协同调控形成层活性为探究GA和Auxin如何协同调控形成层活性,对GA下调转基因株系使用外源生长素处理,可以恢复形成层活性;在形成层特异性上调GA水平的转基因株系中阻断生长素信号,形成层干细胞活性受到抑制,表明GA对形成层活性的调节依赖于生长素信号转导。分别使用GA和生长素处理在形成层区域特异性阻断GA信号的转基因株系,发现其不再响应GA,同时其对Auxin的响应明显变弱,表明生长素对形成层调控也部分依赖于GA信号。这些结果显示,GA和Auxin对形成层活性的调控依赖于彼此的信号转导。4)ARF7与DELLA和Aux/IAA蛋白形成三元复合体为了搞清GA、Auxin信号如何协同调控形成层活性,酵母筛选发现,DELLA能够与生长素信号关键组分因子ARF6、ARF7和ARF8发生互作。基因表达分析发现,ARF6、ARF8、ARF7.1、ARF7.4随着初生生长向次生生长的转变,表达下调,而ARF7.2和ARF7.3呈现出上调趋势。使用Bi FC和Co IP进一步证实,ARF7.2与DELLA蛋白可互作。对ARF7.2的结构域进行截短并与不和DELLA蛋白互作的ARF5结构域进行置换,在酵母双杂交中显示,ARF7的MR结构域介导DELLA蛋白和ARF7互作,不同于介导Aux/IAA与ARF互作的PB1结构域,因此,推测三者可能形成复合体。酵母三杂交,萤光素酶双分子互补和Co IP实验进一步表明,ARF7可作为分子桥梁与DELLA和Aux/IAA蛋白互作形成三元复合体,在杨树体内整合GA和生长素信号通路。5)ARF7介导GA和Auxin信号调控形成层活性构建ARF7.2的转基因过表达株系和ARF7.2、ARF7.3共同敲除株系,切片分析形成层表型,确定ARF7是形成层活性的正向调控因子。使用GA和Auxin处理arf7.2 arf7.3共同敲除株系,发现其形成层对GA和Auxin的响应消失。在过表达RGL1的背景下,过表达不与DELLA蛋白互作的ARF7.2变体,形成层活性的抑制效果被恢复。这些结果表明,ARF7参与介导GA和Auxin信号调控形成层活性。6)ARF7直接激活WOX4基因的表达促进形成层活性通过高通量转录组数据分析,确定GA和Auxin诱导表达的下游基因,利用Aspwood形成层表达数据进一步筛选,发现形成层活性调控关键因子WOX4响应GA和生长素诱导。定量PCR分析进一步验证了WOX4处于GA和Auxin信号的下游,受到DELLA蛋白RGL1和ARF7调控。启动子结合位点分析表明,在WOX4的启动子存在多个ARF结合位点。染色质免疫共沉淀表明ARF7能够直接结合WOX4启动子,酵母单杂交和凝胶阻滞分析进一步证实了该结合。使用双萤光素酶报告系统并进行外源激素处理发现,ARF7能够直接激活WOX4表达,分别加入DELLA蛋白RGL1和Aux/IAA蛋白IAA9,显著抑制ARF7对WOX4的激活作用,同时添加RGL1和Aux/IAA9抑制效果进一步加强,使用GA和NAA处理,降解DELLA蛋白和Aux/IAA9,释放ARF7的激活活性,促进WOX4的表达。上述结果表明,ARF7通过与DELLA蛋白及Aux/IAA9互作,整合GA和生长素信号激活WOX4表达。7)ARF7介导GA信号直接调控PIN1表达促进生长素在形成层中的累积已有研究表明,生长素存在正向的自我反馈,而生长素外流转运体PIN1也受到GA的正向调控。为探究GA在调控形成层活性过程中是否影响生长素极性转运,对GA水平改变的转基因株系和外源GA处理的株系中PIN1的表达进行分析,表明GA能够促进PIN1表达。进一步使用GA处理PIN1蛋白的荧光标记株系,发现GA促进PIN1蛋白累积。使用免疫荧光和LC-MS/MS对GA水平改变的转基因株系茎中生长素IAA的含量进行检测,表明GA促进生长素在形成层累积。进一步分析形成层特异阻断GA信号的转基因株系、ARF7的转基因过表达株系及敲除株系,发现PIN1介导的生长素累积受到GA信号和ARF7共同调控。PIN1启动子包含多个ARF7结合元件,染色质免疫共沉淀、酵母单杂交和凝胶阻滞实验表明,ARF7能直接结合PIN1启动子。双荧光素酶报告系统验证得知,ARF7对PIN1的调控依赖于启动子上ARF的结合位点。上述结果表明,ARF7介导GA信号直接调控PIN1表达促进生长素在形成层的累积。综上所述,ARF7通过整合GA信号和生长素信号,调控杨树维管形成层活性。ARF7通过和DELLA蛋白、Aux/IAA形成三元复合体,响应GA和生长素信号,并且通过直接结合WOX4和PIN1的启动子,激活这些基因的表达,调控形成层活性和生长素累积。