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本研究从奶牛血液中提取基因组DNA,以其为模板,通过Long andAcute PCR扩增β-酪蛋白5'端约长6.5 kb和4.5 kb的两段序列。凝胶回收纯化后,分别将其连在pMD18-T载体上,组成质粒pGBC6-5和pGBC4.5。经测序分析,其与GenBank中登录的山羊β-酪蛋白全基因序列基本相同。通过设计特异性引物在GBC6.5,GBC4.5的5、3'端分别加上BspE I和Sal I酶切位点。pGBC6.5和pGBC4.5的PCR产物经BspE I和Sal I双酶切后,回收纯化,分别克隆入pEGFP-C1载体,构建出中间载体pEGFP-4.5和pEGFP-6.5。以pBL为模板,扩增人乳铁蛋白基因eDNA (hLF cDNA),同时在其5'端加上Sal I酶切位点,在3'端加上Bam HI酶切位点。hLF cDNA的PCR产物经Sal I、BamHI双酶切后,回收纯化,克隆至pEGFP-4.5和pEGFP-6.5。最终构建p6.5hLF-EGFP和p4.5hLF-EGFP乳腺特异性表达载体。
经酶切,序列测定及PCR鉴定,表明载体成功构建。载体的特点是:①调控序列GBC4.5为山羊β-酪蛋白启动子和增强子区域长约4.5 kb的5'端侧翼序列;GBC6.5为包括第一外显子、第一内含子和部分第二外显子以及5'端侧翼区共约6.5 kb的DNA序列。②设计引物时加终止密码子TAA,防止β-酪蛋白与EGFP基因形成融合蛋白,以及保护碱基,保证较好的酶切效果。③载体含有EGFP基因和抗性基因neo,用于对转染细胞的筛选。
通过脂质体介导转染山羊胎儿成纤维细胞,经G418抗性筛选3~4周后得到阳性细胞p6.5hLF-EGFP-FFC和p4.5hLF-EGFP-FFC;p6.5hLF-EGFP-FFC和p4.5hLF-EGFP-FFC经多重PCR鉴定、EGFP表达检测以及染色体核型分析后,得到稳定整合有hLFcDNA且位于染色质开放区的具有正常核型的山羊胎儿成纤维细胞系p6.5hLF-EGFP-FFC和p4.5hLF-EGFP-FFC,为制备人乳铁蛋白的转基因山羊乳腺生物反应器提高核移植供体细胞。