论文部分内容阅读
牙组织工程近年来成为组织工程学的一个重要分支,其促进了生物牙根及牙髓牙本质再生的发展。近年来,牙组织工程受到越来越多的关注,成为学者的研究热点。其包括两大要素即种子细胞和支架材料。作为一种新的牙源性干细胞,根尖牙乳头干细胞于2006年被Sonoyama等人发现。该细胞位于未发育完全的牙根根端,是一种来源于成体间充质的干细胞。根尖牙乳头干细胞增殖、迁移与分化能力较牙髓干细胞及牙周膜干细胞强,同时其免疫原性低。作为牙源性干细胞,根尖牙乳头干细胞(SCAPs,stem cells from apical papilla)的这些特征为其在牙髓牙本质再生中的应用提供广阔的前景。环磷酸腺苷(c AMP,cyclic adenosine monophosphate)-环磷酸腺苷依赖的蛋白激酶A(PKA,protein kinase A)信号通路分布于多种细胞中,调节细胞的增殖和分化(如骨髓间充质干细胞、牙髓干细胞)。SCAPs和骨髓间充质干细胞(BMMSC,bone marrow mesenchymal stem cell)同属来源于间充质的干细胞,并且SCAPs与牙髓干细胞(DPSC,dental pulp stem cell)同是牙源性干细胞。c AMP信号通路与其他信号通路可以相互作用,如骨形成蛋白(BMP,bone morphogenetic protein)和核转录因子κB信号(NF-κB,nuclear factor kappa-B)。而BMP和NF-κB又可以调节SCAPs的增殖、迁移与分化。因此,我们推测c AMP/PKA在SCAPs的增殖、迁移与分化中可能有一定的调节作用。但是尚未见关于c AMP/PKA信号调节SCAPs增殖与分化的报道。目的观察SCAPs中是否存在c AMP/PKA信号通路,同时探索该信号通路在SCAPs增殖与定向分化中的调节作用。方法酶消化法培养原代细胞;流式细胞术分析细胞表面标记分子;矿化/成脂诱导液诱导细胞后,茜素红和油红O染色鉴定细胞多分化潜能;PCR(PCR,polymerase chain reaction)及QPCR(QPCR,Quantitative polymerase chain reaction)鉴定SCAPs中是否存在c AMP/PKA信号;分别用不同浓度的c AMP/PKA信号通路激活剂Forskolin和抑制剂H-89处理细胞,然后MTT和划痕实验检测各组细胞的增殖能力及迁移能力;在矿化诱导液中分别加入c AMP/PKA信号通路的激活剂及抑制剂,茜素红染色及定量分析检测各组中SCAPs钙盐沉积情况,QPCR分析各组中矿化基因的表达情况。结果1 SCAPs的分离、培养与鉴定选取16-18岁因正畸或阻生需要拔除的健康第三磨牙,钝性分离组织,酶消化法培养出原代细胞。流式细胞术结果表明所培养细胞高表达干细胞表面标记分子CD105,CD44,CD90,低表达表皮细胞表面标记分子CD45。该细胞在成骨/成脂诱导液诱导下,形成矿化结节及脂滴,说明其能向成骨/成脂细胞分化。2 c AMP/PKA分布于SCAPs中PCR证实SCAPs中表达c AMP受体PKA。QPCR结果表明激活c AMP后,SCAPs中PKA的表达上升。以上说明SCAPs中存在c AMP/PKA信号。3 c AMP/PKA对SCAPs增殖的影响低浓度Forskolin(2.5μmol/l)促进SCAPs增殖,高浓度Forskolin(10μmol/l,20μmol/l)则抑制其增殖。1μmol/l的H-89在MTT第一天及第三天抑制该细胞增殖,而在第五天和第七天则促进其增殖。H-89(5μmol/l,10μmol/l)抑制c AMP信号后,SCAPs的增殖能力增强。但20μmol/l的H-89在MTT第三天促进SCAPs增殖,在第五天和第七天抑制其增殖。4 c AMP/PKA对SCAPs迁移的影响Forskolin(10μmol/l,20μmol/l)激活SCAPs内的cAMP信号后,其迁移能力下降。相反,用H-89(5μmol/l,10μmol/l)处理该细胞后,其迁移能力增强。5 c AMP/PKA对SCAPs定向分化的调节激活SCAPs内的cAMP/PKA信号通路后,该细胞钙盐沉积增加。与对照组相比,激活剂组矿化基因ALP,OCN,OSX,RUNX2的表达上升。而抑制剂组钙盐沉积减少,矿化基因OCN,OSX,RUNX2的表达降低。结论c AMP/PKA信号通路对根尖牙乳头干细胞增殖、迁移与定向分化有一定的调节作用。综上所述,本研究证实c AMP/PKA信号在SCAPs增殖、迁移与定向分化中有一定的调节作用,为SCAPs在牙组织工程中的应用提供了一定的理论依据。