美国白蛾核型多角体病毒(Hyphantria cunea Nuclear Polyhedrosis Virus,HycuNPV)作为一种强效、无危害、专化性强和环境友好型的生防致病因子,在美国白蛾种群的持续防控中占据重要地位。本论文通过高效、快速的HycuNPV定量检测方法和ORF72基因的研究,为该病毒的持续控制提供了可行的监测方法,同时弥补了其在ORF72基因功能研究上的空白。论文研究结果如下:1.利用TaqMan探针法成功建立了实时荧光定量PCR对HycuNPV含量进行检测的方法。首先,将polh基因构建到pGEM-T-easy载体上,制备标准品质粒。然后,将标准品质粒10倍梯度稀释为1.0×10~8、1.0×10~7、1.0×10~6、1.0×10~5、1.0×10~4和1.0×10~3copies/μL 6个梯度浓度,以此为模版进行荧光定量PCR,建立标准品的扩增曲线和标准曲线。最后,通过得到的标准曲线计算出幼虫在接毒后的不同时间点其体内所含的病毒拷贝数。验证方法:以取食3.0×10~6PIB/mL浓度病毒的美国白蛾幼虫基因组DNA为模版,进行荧光定量PCR后发现,病毒在幼虫体内的含量在第5d开始呈大幅增长趋势,第6d时达到最高。2.ORF72基因的研究。将克隆的ORF72基因构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,对其进行诱导表达,优化表达的条件,并通过GST亲和层析色谱柱纯化融合蛋白。通过SDS-PAGE凝胶电泳显示,ORF72蛋白能够与pGEX-4T-1载体上的GST标签蛋白进行融合表达,诱导表达后的融合蛋白大小约为38.2kDa。优化后的表达条件为:异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的最佳诱导浓度为1.0mmol/L,最佳诱导温度为25℃,最佳诱导时间为4h,并且该蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21和Rosetta表达菌株中均能得到很好的表达,但在Rosetta菌株中诱导的蛋白表达量更高。诱导表达并纯化出ORF72融合蛋白,为后续生物功能的研究奠定基础。