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天然自身抗体(natural autoantibody,NAA)是指在没有任何抗原免疫的情况下，正常机体产生的针对一种或多种自身抗原的抗体。对NAA的研究表明，健康人体免疫系统中存在着一个庞大而复杂的自身抗体网络。包括抗角蛋白自身抗体(antikeratin autoantibody,AK auto Ab)在内，迄今已经发现并证实的NAA有数百种，如抗RBC、MHC、DNA、转铁蛋白、脂类和多糖的抗体以及Jerne免疫调节网络中的抗独特型抗体(anti-idiotype antibody)等。由于个体出生即有NAA，且NAA具有作用范围广、没有特异的选择性、反应出现快、有相对的稳定性等天然免疫的特点，NAA被认为是天然免疫(innate immunity/natural immunity)的重要组成部分。从不同角度对NAA的研究显示：NAA的产生可能与自身反应性B细胞克隆阳性选择过程有关；NAA对外可以抵御外来微生物的入侵；对内可以维持机体内环境的稳定，引起自身耐受，调节免疫和抗肿瘤。因此，对NAA产生机理的揭示将有助于回答免疫学B细胞产生、发育以及自身耐受的问题；对NAA功能的研究有助于进一步明确NAA对机体的意义；对NAA的特性、编码基因、与病理性自身抗体界限和关系的研究可能对自身 第四军医大学硕士学位论文免疫疾病的发病机制和治疗提供有益的线索。 AK auto Ah广泛存在于正常人体内，包括可分别结合不同分子量角蛋白的抗体。以往关于 AK auto Ah的研究，已较为深刻的揭示了这种自身抗体的生物学性质与作用。AK auto Ah主要具有 IgG、IgM两种同种型。关于 AK auto Ah的产生机制研究表明：未经免疫的小鼠的脾细胞即可自发产生 AK auto Ah。其后，众多学者从不同侧面对AK auto Ah的生物学作用进行了探索。Hinter等通过研究发现 IgG型AK auto Ah 对不溶性的角蛋白中间丝（kerati intermediateilament，KIF）凝集物具有调理吞噬作用。还有研究表明，AK auto Ah常常包绕结合于进入真皮中的角蛋白小体伙eratin body3KB卜从而有可能积极地参与了KB的清除过程。 我们实验室对 AK auto Ah进行了广泛深入的研究，主要研究分为以下几个阶段：1．利用亲和色谱法从正常人混合血清中纯化了AKauto Ah。2．发现纯化的 AK auto Ah对体外培养的角质形成细胞的增殖具有抑制作用。3．建立了不同血清 AK auto Ah滴度的动物模型，发现正常血清滴度的 AK auto Ah对皮肤的损伤具有保护作用，并能促进组织的修复。4．AK auto Ah对银屑病动物模型皮炎的转归具有促进作用。5．临床上给银屑病患者输注富含 AK auto Ah的免疫球蛋白能明显促进皮损的康复。6．在发现 AK auto Ah具有一定临床应用前景的前提下，应用抗体库技术获得基因工程抗体。7．在分子水平对 AK auto Ah的作用机理进行研究。其中，在分子水平阐明 AK auto Ah的作用机制，是全面阐明 AK auto Ah生物学作用、临床应用 AK auto Ah的基础。信号转导研究显示，AK auto Ah作用鳞癌细胞后，引起PKC、CAMP、CaZ”明显下降。 在应用体外实验研究AK auto Ah作用机制的同时，AK auto Ah 4 第四军医大学硕士学位论文阻止鳞癌细胞发展的作用也同时被揭示。由于鳞癌细胞来源于恶性角质形成细胞，表达角蛋白抗原，具有易培养等特点，鳞癌细胞株Tea细胞株是我们实验室研究 AK auto Ah作用机制常采用的细胞株。采用胶体金透射电镜技术，通过缩短抗角蛋白单克隆抗体与Tea细胞共孵育时间（3 h），保持Tea细胞细胞膜的完整性以及正常的通透性，进而对孵育后的Tea细胞进行固定包埋，在电镜下观察到Tea细胞胞浆中间丝处有簇集的胶体金颗粒l”］。这强烈提示 AK auto Ah可穿过完整的细胞膜，进入活的鳞癌细胞，并结合于细胞内的张力纤维细丝和桥粒。鳞癌 Tea细胞株与浓度大于 2．sing／ml的 AK auto Ah共孵育 32 ，J’时后，Tea细胞间隙增大，细胞呈片状分离，胞浆内出现少许颗粒，可见有细胞破碎。经 AK auto Ah作用后，Tea细胞的增殖显著抑制，且这种抑制呈抗体剂量依赖的方式［6‘］。体外研究为证实 AK auto Ah与鳞癌的关系提供了有力的证据，同时提出了新的问题：AK auto Ah可以进入活的鳞癌细胞，显著抑制鳞癌细胞的增殖，那么，AK auto Ah与靶抗原结合后，抑制鳞癌细胞增殖的机理是什么？明确上述问题需要对与肿瘤细胞增殖相关的重要分子进一步研究。以往研究显示端粒酶在鳞癌细胞明显活化，与肿瘤发生、增殖密切相关。因此，本实验选择端粒酶分子，观察 AK auto Ah作用鳞癌细胞后端粒酶活性是否改变，拟探讨端粒酶在抑制机制中可能发挥的作用。 （一）主要实验内容 1 细胞培养 分别对鳞状细胞癌细胞系 Teasll3 细胞和正常人角质形成细胞进行细胞培养。 2 AK auto Ah对 Tea细胞端粒酶活性的影响通过亲和层析得到的AK auto Ah，以 DMEM完全培养液稀释为 4、8、16mg／L，与 Tea细