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目的制备新型AMO/PF6纳米探针,研究探针在miRNA-21过表达肺腺癌模型中的反义显像价值。方法设计合成Cy5.5荧光标记的miRNA-21反义寡核苷酸序列(anti-miRNA oligonucleotide,AMO)以及穿膜肽(PepFect6,PF6)。将PF6(原液100 mM)与AMO(原液10mM)在超纯水中混合,室温下孵育30 min,获得AMO/PF6纳米探针。PF6与AMO(终浓度为75nM)的摩尔比率(molar ratio,MR)为30:1,电荷比为2:1。采用脂质体转染试剂(Lipofectamine 2000,LIP)作为对照,同时合成AMO/LIP纳米探针。使用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)从大小、形状等方面对AMO/PF6纳米探针进行表征,并与AMO/LIP纳米探针进行比较。将AMO、AMO/PF6与AMO/LIP纳米探针分别转染肺腺癌A549细胞,于转染6 h与8 h后,激光扫描共聚焦荧光显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)观察转染效果。通过细胞增殖-毒性试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK8)检测AMO/PF6纳米探针细胞毒性。设计AMO的终浓度分别为50 nM、75 nM、100 nM和200 nM,AMO与PF6MR包括10:1、20:1和30:1,以实验组与空白对照组之间吸光度值(OD)的比值作为细胞相对存活率,比较AMO、AMO/PF6、AMO/LIP在不同条件下的细胞毒性。构建A549肺腺癌荷瘤鼠模型,分别于尾静脉注射10%葡萄糖溶液(校正荧光显像系统)、AMO-10%葡萄糖溶液、AMO/PF6-10%葡萄糖溶液、AMO/LIP-10%葡萄糖溶液。10%水合氯醛麻醉后,利用小动物活体成像系统(in vivo imaging system,IVIS)检测活体内荧光信号的分布(每30 min显像1次,至150 min结束)。采用Image-Pro Plus 6.0软件选取肿瘤与肝脏的感兴趣区,计算每组肿瘤与肝脏的摄取比值(Tumor/Liver,T/L),并进行统计学分析。组织体外成像及冰冻切片成像:活体成像结束后,动物脱颈处死,进行体外成像及冰冻切片成像,检测体内外成像AMO分布是否有差异。采用两独立样本t检验比较两组之间的差异性,P<0.05认为有显著统计学差异。结果成功合成AMO/PF6纳米探针。TEM观察可见,AMO/PF6纳米探针近球形,表面光滑,直径在30-40 nm范围;AMO/LIP纳米探针近椭球形,表面粗糙,直径在50-70nm范围。转染6 h与转染8 h后,AMO组A549细胞内只可见少量的荧光信号。AMO/LIP探针组转染6 h后,A549细胞内出现大量荧光信号,延长至8 h,荧光信号增加,信号分布在细胞核和细胞质。AMO/PF6探针组转染6 h后,A549细胞内同样出现大量荧光信号,延长至8 h,荧光信号明显增加,且多于AMO/LIP组,主要分布在细胞质内。CCK8细胞毒性实验结果显示,与空白组相比,AMO、AMO/PF6与AMO/LIP纳米探针均有一定的细胞毒性。在相同的浓度条件下,AMO细胞毒性最低,相对存活率最高(50 nM组:89.89%,75 nM组:90.10%,100 nM组:88.15%,200 nM组:87.73%)。在AMO终浓度为75 nM时,3组细胞的相对存活率相比与其他浓度均为最高(AMO组:90.10%,AMO/PF6组:89.42%,AMO/LIP组:86.33%)。PF6与AMO在MR为30:1的条件下,AMO终浓度为75 nM时,细胞相对存活率最高(10:1组88.92%,20:1组88.81%,30:1组89.42%)。比较AMO/PF6探针与AMO/LIP探针细胞毒性发现,PF6与AMO无论在何种比例下混合,AMO/PF6组探针的细胞相对存活率都高于同浓度下AMO/LIP组探针,在MR为30:1的条件下,AMO/PF6组与AMO/LIP组之间的差异具有统计学意义(50 nM组:89.17±0.73%vs.85.98±0.23%,P=0.014;75 nM组:89.43±0.48%vs.86.33±0.14%,P=0.004;100 nM组:87.46±0.45%vs.81.95±0.94%,P=0.006;200 nM组:85.31±0.47%vs.78.94±0.93%,P=0.004)。注射AMO-10%葡萄糖溶液120 min后,荧光信号主要聚集在肝、肾、肿瘤,T/L比值最高为1.118±0.004。在注射AMO/LIP探针120 min后,荧光信号聚集在肝、肾、肿瘤,但在注射150 min后,肺出现荧光信号的聚集。在AMO/PF6组120 min显像时,荧光信号聚集在肿瘤、肝、肾,延长至150 min肺未有信号的聚集。AMO/PF6组与AMO/LIP组、AMO组相比,T/L最高,且差异具有统计学意义(T/L:1.716±0.002 vs.1.352±0.018,P<0.0001)。动物离体组织体外成像显示,除心、胃外,其他组织荧光信号的分布与体内成像一致。在冰冻切片中,显示了与体外组织成像一致的分布结果。结论荧光标记的新型AMO/PF6纳米探针制备简单,细胞毒性低,转染效率高,在A549肺腺癌荷瘤鼠中具有优良靶向miRNA-21反义显像性能。