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信号素(semaphorin, SEMA)是一类膜结合蛋白质家族,最初被认为是神经系统中的一种轴突导向因子,后来人们发现该家族成员在肿瘤组织中的表达出现异常,并影响肿瘤进程。信号素4A(semaphorin 4 A, SEMA4A)是该家族成员之一,主要以膜结合蛋白的形式存在,但其胞外段可经蛋白水解断裂释放到细胞外的微环境中。SEMA4A多表达于免疫细胞并参与炎性反应,但其在肿瘤细胞中的表达及功能尚不清楚。肿瘤微环境中肿瘤细胞与间质细胞间的相互作用是促进前列腺癌(prostate cancer, PCa)转移的重要因素,释放到微环境中的SEMA4A发挥怎样的作用也尚需明确。通过本研究发现SEMA4A在前列腺癌中的表达明显升高,且与Gleason评分及肿瘤远处转移相关；体内外实验证明SEMA4A可促进肿瘤细胞的侵袭和转移,并且该作用是通过调节前列腺癌细胞的上皮-间质转换发生的。重要的是,我们发现SEMA4A可上调间质细胞中IL-10的表达和分泌,而IL-10又进一步促进前列腺癌细胞中SEMA4A的表达,两者在促进肿瘤细胞转移方面存在协同性。即在肿瘤微环境中,SEMA4A和IL-10很有可能形成正反馈调控途径,促进前列腺癌细胞的转移。另外,本研究还发现SEMA4A和IL-10共同受到STAT3表达调控,并且前二者在发挥作用时也依赖于STAT3o综上,通过本研究较为系统探讨了SEMA4A在前列腺中的表达和功能,发现其作为一种癌基因,可促进前列腺癌侵袭转移的发生；另外,该分子可能介导了肿瘤细胞与间质细胞的相互作用,协同IL-10促进癌变进展。研究目的：1、分析SEMA4A在我国前列腺癌患者组织中的表达特点2、研究SEMA4A对前列腺癌细胞的作用及其机制3、探讨SEMA4A在前列腺癌肿瘤微环境中的作用及其机制研究方法：1、分析SEMA4A在我国前列腺癌患者组织中的表达特点1.1免疫组织化学法检测SEMA4A在PCa及BPH组织中的表达情况,并结合其他病理指标分析其异常表达的临床意义。1.2利用GEO数据库对SEMA4A在前列腺癌中的表达情况进行分析。1.3运用RT-qPCR法及Western Blot法检测SEMA4A在前列腺癌各细胞株中的表达情况。2、研究SEMA4A对前列腺癌细胞的作用及其机制2.1 MTS法检测加入SEMA4A小干扰RNA (siRNA)或重组人SEMA4A蛋白(rhSEMA4A)后,细胞的增殖能力变化。2.2 Transwell小室法检测加入SEMA4A小干扰RNA(siRNA)或重组人SEMA4A蛋白(rhSEMA4A)后,细胞迁移能力的变化。2.3分别用RT-qPCR法及Western Blot法检测加入SEMA4A小干扰RNA(siRNA)或重组人SEMA4A蛋白(rhSEMA4A)后,细胞内EMT指标表达在mRNA水平和蛋白水平的变化情况,并找出其作用受体。3、探讨SEMA4A在前列腺癌肿瘤微环境中的作用及其机制3.1采用细胞因子蛋白芯片及ELISA检测SEMA4A对间质细胞WPMY-1的细胞因子分泌情况的影响,并筛选出其作用于间质细胞时所依赖的受体。3.2 Transwell小室法检测加入重组IL-10后,前列腺癌细胞迁移能力的变化。3.3间接共培养与Transwell小室法相结合,检测肿瘤细胞与间质细胞共培养对肿瘤细胞迁移能力的影响。并用siRNA方法沉默SEMA4A的表达或用IL-10中和抗体阻断IL-10的效应,以验证SEMA4A与IL-10在共培养体系中发挥的作用。3.4向裸鼠体内单独注射肿瘤细胞或将肿瘤细胞与间质细胞混合后注射,比较双肺转移灶的数量,以验证肿瘤微环境中肿瘤细胞与间质细胞相互作用对肿瘤转移的影响以及SEMA4A在这其中可能发挥的作用。3.5 Western Blot验证STAT3对SEMA4A表达调控的作用,并通过染色质免疫共沉淀法(ChIP)验证STAT3与SEMA4A启动子区的结合情况。3.6在共培养体系或体内实验中加入STAT3的选择性抑制剂Stattic以证明SEMA4A在肿瘤微环境中主要通过STAT3途径发挥作用。结果：1、 SEMA4A在我国前列腺癌患者组织中的表达高于正常或良性增生的前列腺组织,且主要表达于癌细胞的胞膜上,其在癌细胞的胞浆中及间质细胞中均没有表达。结合临床病理指标分析,SEMA4A高表达与前列腺癌Gleason评分及转移相关。2、 SEMA4A可在体外促进前列腺癌细胞的迁移能力而对该细胞增殖能力的影响不明显。此外,本研究发现,SEMA4A可促进肿瘤细胞EMT进程的发展,并可能是其促进肿瘤细胞迁移的主要途径。3、SEMA4A可通过间质细胞上的NRP-1受体发挥作用,促进间质细胞分泌IL-10,而IL-10也可作用于肿瘤细胞并上调SEMA4A的表达。两者可协同发挥作用,促进前列腺癌细胞发生迁移。此外,IL-10可激活前列腺癌细胞上的STAT3信号通路,经活化的P-STAT3可入核并直接结合于SEMA4A的启动子区,从而调控SEMA4A的转录表达。SEMA4A/IL-10/STAT3在前列腺癌肿瘤微环境中形成正反馈调节途径,并推动前列腺癌的EMT进程,促进肿瘤细胞的侵袭转移。结论：SEMA4A可促进前列腺癌的侵袭转移,并是肿瘤微环境中的关键调控因子。