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目的： 对广西产青天葵Nervilia fordii(Hance.)Schltr.不同产地样品进行ISSR（Inter-simple Sequenee Repeat，简单重复序列区间）扩增，根据扩展产物电泳结果，进行青天葵遗传多样性分析，为青天葵真伪优劣鉴别提供科学依据。 方法： （1）采用改良的CTAB（Hexadecyltrimethyl Ammonium Bromide，十六烷基三甲基溴化铵）法提取广西不同产地青天葵基因组DNA； （2）采用单因素和正交设计相结合的方法建立青天葵 ISSR-PCR 的最佳反应体系； （3）利用ISSR分子标记技术对广西不同产地青天葵样品进行遗传多样性分析。 结果： （1）采用改良的CTAB法提取的青天葵基因组DNA质量高，可用于本实验后续研究。 （2）从100 条ISSR引物中筛选出15条扩增稳定、多态性丰富的 ISSR引物。 （3）采用单因素和正交设计相结合的方法确立了青天葵 ISSR-PCR 最佳反应体系：即在20μL的总反应体积中含有10×PCR buffer 2μL，dNTP 225μmol·L-1，Mg2+2.5 mmol·L-1，引物0.4μmol·L-1，Taq DNA聚合酶1.0 U，模板DNA 60 ng。极差分析结果表明：五个因素对ISSR-PCR反应的影响从大到小依次为：Taq酶、Mg2+、模板 DNA、引物、dNTPs。 （4）运用PopGen1.32软件对青天葵ISSR-PCR扩增的实验数据进行统计分析，青天葵的多态性位点百分比（PPL）为83.13%，基因多样性指数（H）为0.3036，Shannon多样性指数（I）为0.4635，在物种总体水平上青天葵具有较高的遗传多样性。 （5）根据Neis遗传距离运用NTsys2.10软件对广西9个产地青天葵样品进行聚类分析，表明广西扶绥县昌平样品和广西上林县镇宇样品亲缘关系较近，广西马山县古零样品和广西上林县镇宇样品的亲缘关系较远。 以相似系数为 0.69 为阈值的水平上可将 9 个产地的青天葵样品分为 3大类：第Ⅰ类为广西马山县古零镇、广西上林县镇宇镇、广西龙州县金龙镇、广西桂林市五通镇和广西桂平市南木镇；第Ⅱ类为广西桂林市平乐县；第Ⅲ类为广西靖西县胡润镇；第Ⅳ类为广西扶绥县昌平镇和广西大新县那岭镇。第Ⅰ类可分为3个亚类，其中第1亚类为广西马山县古零镇和广西上林县镇宇镇；第2亚类由广西龙州县金龙镇、广西桂林市五通镇和广西桂平市南木镇。 结论： 建立的青天葵基因组DNA提取方法简单、快捷，提取的DNA质量高，为进行分子生物学研究提供保障；本实验所优化的ISSR-PCR反应体系进行 PCR 扩展谱带清晰，重复性好，多态性性高，可用于青天葵遗传多样性分析，为青天葵的真伪优劣鉴别提供了科学实验方法。