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前言 全反式维甲酸(ATRA)用于急性早幼粒细胞白血病(APL)的诱导分化治疗，有很高的完全缓解(CR)率，现已成为APL诱导缓解治疗的首选药物。然而，快速发生的耐药性是ATRA治疗APL的一大缺点。此外，少数初治APL病例亦对ATRA不敏感。故ATRA抵抗成为临床很为棘手的问题。另外，在诱导分化治疗同时所出现的白细胞淤滞和维甲酸综合征(RAS)是导致急性早幼粒细胞白血病病人早期死亡的主要原因。尽管联合化疗可以在一定程度上缓解RAS，但RAS并未从根本上解决。 蟾酥是一种传统的中药，其主要活性成分蟾蜍毒素具有很多药理活性，包括强心、麻醉、抗肿瘤等功能。蟾蜍灵(Bufalin)是从传统中药蟾酥中提取的蟾毒配基之一。有研究表明蟾蜍灵诱导HL60，ML1细胞凋亡，诱导K562细胞向粒系细胞分化，并诱导HL60、U937、ML1细胞向单核／巨噬细胞系分化。还有研究提示蟾蜍灵与ATRA、1-25二羟维生素D3、足叶乙甙(VP16)或γ干扰素(IFN-γ)联合应用对HL60、U937和ML-1细胞的诱导分化具有协同作用。但是，关于蟾蜍灵对白血病病人原代培养细胞作用报告很少，有研究提示单用蟾蜍灵作用于原代培养的急性髓性白血病细胞(AML)，对AML细胞的诱导分化作用比较温和，但对APL病人蟾蜍灵能够增强ATRA对APL原代培养细胞的诱导分化作用，而且蟾蜍灵与维甲酸联合应用能够使耐药的早幼粒白血病细胞恢复对ATRA的敏感性。 为了进一步研究蟾蜍灵对ATRA诱导分化的增强效应，我们研究蟾蜍灵与维甲酸联合对APL原代培养细胞的诱导分化作用。 实 验 材 料 一、试剂与实验仪器：硝基蓝四峻（NBT人赡殊灵、ATM购于 Sima公司、荧光标记的鼠抗人 CDllb单克隆抗体＊Dllb－Fee）购于 Codter。unolo部公司；RPMll640购于 GIBCO BRLUSA，胎牛血清购于天津血液研究所。 实 验 方 法 一、细胞培养：新鲜急性早幼粒细胞白血病细胞来源于初诊的 12例 APL病人的骨髓标本。依据密度梯度离心法分离单个核细胞。于含有56℃J0分钟灭活的20％胎牛血清和12U／rTl庆大霉素的 RPMll640，37℃3％CO卜饱和湿度的培养箱进行原代培养。人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4由本室常规传代培养，实验采用对数生长期细胞。 二、细胞增殖测定：采用台盼蓝拒染法。 三、细胞凋亡的检测：形态学分析检测细胞凋亡。 四、细胞诱导分化的检测： 1．细胞形态学分析：采用瑞氏一姬姆萨染色，在显微镜下观察形态学变化。 2．NBT还原试验：计数 200个细胞，计算 NBT阳性百分比。 3．细胞表面标记抗原CDI fo检测：采用流式细胞仪检测。 五、统计学处理：数据采用 SPSS统计软件进行 t检验和 X’检验及方差分析。 ·2· 结 果 一、瞻赊灵抑制NB4细胞增殖及诱导细胞发生凋亡 为观察赡峰灵对NB4细胞增殖的影响，用不同浓度的赡除灵处理NB4细胞1－72小时，采用台盼蓝拒染法检测细胞活力，赡殊灵以时间、剂量依赖的方式抑制NB4细胞增殖，24小时产8 ／J＼时J72 ／J’时抑制细胞增殖 50％的药物浓度问C。＊分别为 51 nM上5nM上 nM。贿赂灵以20 nM扫0nM作用于NB4细胞，分别在24。12小时观察到形态学上的细胞凋亡，细胞胞膜完整，胞核浓缩或碎裂。 二、赡蛛灵增强ATM对NB4细胞的诱导分化作用 赡除灵在低浓度二一0nM单独作用于NB4细胞，并不能诱导NB4细胞分化，而在5－10nM联合ATRA 30nM共同培养4－7天，能够明显增强ATRA对NB4细胞的诱导分化作用。联合应用较单用ATRA，细胞形态上出现胞质颗粒减少，染色质浓集，核质比例减少，部分核仁消失，出现中、晚幼粒细胞及部分杆状核粒细胞，在功能上NBT还原阳性率明显增加。ATRA 30nM与赡除灵 7联合作用于NB4细胞5天，NBT还原阳性率随赡除灵浓度增高而增加，细胞表面标记抗原＊DIu表达也明显增加河＜O．0门。 三、赡蜈灵与ATRA联合应用对APL原代培养细胞的诱导分化作用 我们研究了12例初治病人，高于50nM的赡蜈灵作用于原代培养的APL细胞，其中有4八 例在24－48 ／J’时发生形态学上的凋亡。观察赡除灵5－10nM与ATRA 10—100nM联合共同培养7天对APL原代培养细胞的诱导分化作用，赡蛛灵增强ATRA诱导分化作用的最佳的浓度是suM，ATRA的最佳浓度为30nM－50nM。6八 例单用AM仅表现为轻度分化，而加用螺除灵后能 ·3·够明显促进ATRA对APL原代培养细胞的诱导分化作用，形态学表现为向成熟粒细胞分化，功能上NBT还原率增加了15％－52％，而且瞻蛛灵与ATRA30nM联合时NBT阳性率随着赡蛀灵浓度增加而增加，细胞表面标记抗原 CDllb表达，联合应用较单用ATRA也增加了16％－69％。其中1例瞻殊灵suM 与ATlln．－－onM联合应用第4天NBT还原率已达到87％，而单用ATRA100nM第7天才达到 90阮；4／12例单用 ATM0nM