论文部分内容阅读
伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)引起的一种以侵害中枢神经系统为主要特征的高度接触性动物传染病,猪是其唯一的天然宿主。20世纪80年代我国从匈牙利引进了伪狂犬Bartha-K61减毒活疫苗,有效地控制了PRV在我国的流行;然而从2011年开始,暴发了PRV变异毒株并持续扩散,PRV再一次成为引起我国养猪业重大损失的主要病原之一。针对当前PRV的流行现状,建立更为高效、准确的检测方法对疫情的防控乃至该病的最终根除均有重要意义。本研究首先利用2013年采集于黑龙江省某猪场经鉴定为PRV阳性的组织样品进行病毒分离,经细胞病变观察、PCR检测、间接免疫荧光以及电镜检测证实成功分离出一株RPV,并命名为PRV HLJ-2013。随后,利用高通量测序技术对该病毒的全基因组序列进行了测定,并在基因组、编码蛋白基因以及氨基酸序列等水平上对病毒的进化特征做了分析。结果显示,PRV HLJ-2013的基因组全长为142.56 kbp;该毒株与国内参考毒株同属于基因II型,但在进化树上介于国内分离株和国外分离株之间的一个独立的分支上;该毒株各编码蛋白基因与其他参考毒株相应的编码蛋白基因表现出不同的进化关系,其中UL10(gM)、UL44(gC)、UL36(VP1/2)与国外毒株亲缘关系较近,而US6(gD)、UL19(VP5)与国内早期毒株(如SC、Fa和Ea毒株)处于同一进化分支。以上结果表明PRV HLJ-2013毒株可能为一株出现较早,且持续存在的毒株。PRV HLJ-2013及国内PRV经典株SC和变异株HeN1的细胞接种实验及小鼠致病性实验结果表明,PRV HLJ-2103在PK15细胞上的生长特性与SC及HeN1没有显著差异;HLJ-2013感染小鼠可引起明显的脑及肺组织的损伤,且致病力强于SC毒株,但弱于HeN1毒株。以上结果表明,本研究成功分离并鉴定了一株在遗传及部分生物学特性上与当前其他PRV毒株存在一定差异的新毒株,并且该毒株是我国早起流行毒株的分支。为制备PR化学发光抗体检测方法包被抗原,对PRV HLJ-2013进行了扩大培养,获得浓度为5.2 mg/mL的纯化病毒抗原,满足方法建立需求。利用磁微粒将浓缩PRV抗原包被至其表面,同时将碱性磷酸酶与兔抗猪IgG抗体进行偶联获取酶标二抗,并对封闭剂浓度、洗涤液浓度、酶促发光反应检测时间以及两步免疫反应时间等反应条件进行优化。实验最终确定磁珠最适抗原包被浓度为400μg/mL、酶标二抗的最佳稀释度为1:10000、封闭剂BSA的最佳浓度为2%、PBST洗涤液的最适浓度为0.2%、两步免疫反应的最佳时间是10 min+10 min、酶促发光反应后最佳检测时间为5 min。对猪伪狂犬病抗体磁微粒化学发光检测方法在灵敏度、重复性、特异性和稳定性等方面进行了初步评价,结果表明,本研究建立的诊断方法相对于PRV gB抗体ELISA试剂盒,其灵敏度更高;批内及批间变异系数均小于10%,方法的重复性较好;与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、非洲猪瘟等十种不同病原抗体阳性血清不存在交叉反应;检测方法的各试剂组分稳定性良好。使用本研究建立的方法与商品化ELISA试剂盒共同检测临床猪血清样品,两种检测方法的总体符合率为96.83%;并且两种方法在免疫猪血清检测实验中获得了一致的检测结果。本研究成功分离并鉴定了一株在遗传及部分生物学特性上与国内毒株存在一定差异的PRV HLJ-2013毒株,并以纯化浓缩的全病毒作为包被抗原,建立了基于全病毒的磁微粒化学发光检测方法。该方法灵敏度高、检测时间短、重复性和特异性良好,具有一定的应用前景,可以为免疫猪的PRV抗体监测提供另一种快速的新型检测手段。