论文部分内容阅读
第一部分人参皂苷Rg3对VEGF诱导RF/6A细胞增殖、迁移及管腔形成的影响目的观察人参皂苷Rg3对VEGF诱导的猴脉络膜视网膜内皮细胞(RF/6A)增殖、移行及管腔形成生物学特征的影响,以初步探讨人参皂苷Rg3对脉络膜新生血管(CNV)形成的干预作用,为临床应用人参皂苷Rg3治疗CNV提供体外实验基础。方法1.CCK-8法检测不同浓度人参皂苷Rg3对正常RF/6A细胞增殖活性的影响,确定人参皂苷Rg3安全作用浓度。2.CCK-8法检测不同浓度VEGF对RF/6A细胞的增殖作用,筛选VEGF最佳作用浓度及时间点。3.CCK-8法检测人参皂苷Rg3、康柏西普对VEGF诱导RF/6A细胞增殖的抑制作用,选择人参皂苷Rg3和康柏西普最佳作用浓度。4.将RF/6A细胞分为正常细胞组、VEGF诱导组、VEGF+康柏西普组、VEGF+人参皂苷Rg3组及VEGF+康柏西普+人参皂苷Rg3(联合组)5组,通过CCK-8法检测各组不同干预对细胞增殖活性的影响。5.应用细胞划痕实验检测各组干预对细胞移行能力的影响。6.应用Matrigel管腔形成实验检测各组干预对细胞管腔形成能力的影响。结果1.CCK-8法检测结果显示:高浓度人参皂苷Rg3(270μM)培养细胞24、48、72h后,OD值较正常组低(P<0.05),对细胞生长有抑制作用;不同浓度VEGF诱导细胞48h,50ng/mL VEGF组OD值较其他各组显著增高,差异有统计学意义(P<0.05),诱导细胞增殖作用最佳:10、30、90μM浓度人参皂苷Rg3干预VEGF诱导的RF/6A细胞,结果显示9OμM组细胞OD值均低于10、3OμM组(P<0.05),抑制作用最强;2.划痕实验检测结果显示:划痕后培养24h,各组细胞迁移率比较:VEGF组显著高于正常组(P<0.05),药物干预组显著低于VEGF组(P<0.05);联合组与康柏西普组比较,差异无统计学意义(P>0.05),但均低于人参皂苷Rg3组(P<0.05);划痕后培养48h,各组细胞迁移率比较:联合组<康柏西普<人参皂苷Rg3,均显著低于VEGF组(P<0.05)。3.Matrigel管腔形成检测结果显示:干预培养24h,管腔数目比较:VEGF诱导组(48±3.61)显著高于正常组(34.33±3.51),药物干预各组显著低于VEGF诱导组(P<0.05);其成管能力比较:人参皂苷Rg3>康柏西普组>联合组,组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论1.人参皂苷Rg3和康柏西普均能抑制VEGF诱导的RF/6A细胞增殖、迁移和管腔形成,从而抑制CNV的形成。2.人参皂苷Rg3与康柏西普联合应用显示出良好的协同作用,其抑制作用明显优于单独应用组。第二部分人参皂苷Rg3干预BN大鼠实验性CNV形成的作用及机制研究目的1.观察532nm激光诱导BN大鼠CNV形成的可行性。2.观察TNF-α/NF-κB和HIF-1α/VEGF信号通路在激光诱导BN大鼠CNV形成中的作用。3.观察人参皂苷Rg3对激光诱导BN大鼠CNV形成的干预作用,探讨其可能作用机制,为临床可能应用人参皂苷Rg3治疗CNV提供体内实验基础。方法1.通过应用532nm激光(功率300mW、光斑直径50μm、曝光时间0.05s)诱导建立BN大鼠CNV动物模型,分别于光凝后1、3、5、7、14、21d时间点,通过FFA与ICGA检测观察CNV的发生发展变化。分别于相应时间点处死动物,制作病理学标本,应用HE染色观察视网膜脉络膜组织病理学变化。2.激光诱导BN大鼠CNV动物模型,于光凝后3、7、14d时间点处死动物,制作分子生物学标本,分别应用RT-qPCR法、Western Blot法和ELISA法检测,观察TNF-α/NF-κB和HIF-1α/VEGF信号通路相关因子在实验性CNV形成中的表达变化。3.激光诱导BN大鼠CNV动物模型,随机分为正常组、模型组、人参皂苷Rg3低、中、高剂量组和阳性对照组(康柏西普组)6组,分别给予相应干预,于干预后7d进行FFA、ICGA、HE染色、RT-qPCR法和Western法检测,观察各组相应指标变化。结果1.FFA和ICGA观察显示:模ld、3d、5d组仅有少量光凝斑荧光渗漏,模7d组光凝斑可见大量高荧光(63.33%),模14d组荧光渗漏光凝斑增加(76.67%),至模21d稳定(66.67%)。荧光渗漏平均光密度值比较,模14d组(159.50±16.42)高于模 7d 组(127.56±10.50)(P<0.05),与模 21d 组(131.49±7.19)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。HE染色观察CNV最大中央厚度比较:模14d组(75.87±7.13)高于模 7d 组(56.90±1.03),和模 21d 组(61.98±6.87)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2.RT-qPCR法和Western Blot法检测大鼠视网膜脉络膜复合体相关目的基因表达显示:在mRNA表达水平,模型组TNF-α和NF-κB均高于正常组(P<0.05),模7d组明显高于模3d组(P<0.05),模14d组低于模7d组(P<0.05)。模型组的HIF-lα、VEGF均较正常组明显增加(P<0.05),模7d组明显大于模3d组(P<0.05),模14d与模7d比较差异无统计学意义(P>0.05)。在蛋白相对表达水平,各因子蛋白表达变化趋势同RT-qPCR法检测结果。ELISA法检测大鼠腹主动脉血清各因子的蛋白相对浓度,结果显示:各组TNF-α、NF-κB表达量比较:模7d组>模14d组>模3d组>正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。各组HIF-lα、VEGF表达量比较:模7d组>模3d组>正常组,模14d与模7d比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3.人参皂苷Rg3低、中、高剂量和康柏西普干预模型7d后,荧光渗漏平均光密度值比较,除人参皂苷Rg3低剂量组外,各治疗组均低于模型组(P<0.05),其中康柏西普组最低,人参皂苷Rg3高剂量次之,低于中剂量组。HE染色显示,各组CNV最大中央厚度从小到大依次为:康柏西普组(27.78±1.67)、人参皂苷Rg3高剂量组(32.79±2.28)、中剂量组(41.93±4.68),均低于参皂苷Rg3低剂量组和模型组,后两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。RT-qPCR法检测显示:在mRNA水平,模型组与人参皂苷Rg3低剂量组无差异,均高于与各组(P<0.05)。康柏西普组和人参皂苷Rg3中剂量组在TNF-α表达无差异,均高于人参皂苷Rg3高剂量组。在NF-κB表达上,康柏西普组和人参皂苷Rg3高剂量组无差异,均低于人参皂苷Rg3高剂量组。HIF-lα、VEGF表达量比较,各治疗组由高到低依次为:康柏西普组、人参皂苷Rg3高剂量、中剂量组,模型组与人参皂苷Rg3低剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Western Blot法检测显示,在蛋白表达水平,各组目的基因表达变化趋势同RT-qPCR检测结果。结论1.应用532nm激光光凝能够成功诱导BN大鼠CNV动物模型。激光光凝后7d至14d是CNV快速生长发展时期,至21d趋于稳定。2.TNF-α/NF-κB和HIF-1α/VEGF信号通路参与激光诱导BN大鼠CNV的形成,相关通路因子表达增加,诱导血管生成。3.人参皂苷Rg3对激光诱导大鼠CNV的形成具有抑制作用,其机制可能是通过抑制CNV形成早期TNF-α/NF-κB和(或)HIF-1α/VEGF信号通路的激活,降低相关因子的表达,从而抑制CNV的形成。