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研究背景胆管细胞癌(cholangiocarcinoma,CCA)是一种来源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤,约占人类全部恶性肿瘤的3%。2017年第八版美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)和国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control,UICC)的分类中将胆管癌按不同部位分为肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)、肝门部胆管癌(perihilar cholangiocarcinoma,PHCC)和远端胆管癌(distal cholangiocarcinoma,DCC)。研究发现,不同的解剖位置的胆管癌具有其独特的危险因素、发病机制、治疗方案以及预后。PHCC是最常见的胆管癌类型,占所有胆管癌的50%以上,其临床预后最差。由于PHCC的早期症状不显著,大多数患者一经诊断便失去了根治性切除的机会。同时,因PHCC解剖关系复杂,临床上行根治性切除的难度较大。然而相关研究表明,即使行根治性切除术的患者,PHCC的5年总生存率(overall survival,OS)也仅为30%。近年来,由于术前诊断、手术方式及术后护理等各个方面技术的提升,让PHCC患者的整体预后得到了一定改善。国内许多专家主张行围肝门切除术,用于治疗Ⅲ、Ⅳ型PHCC,取得了一定的临床疗效,延长了部分患者的生存时间。但由于手术难度大,技术要求高,加之术后恢复时间长,使得此术式难以在基层医院推广。PHCC的预后不良部分原因在于缺乏有效的辅助治疗手段,其化疗或放疗的效果有限,且没有可用于一线的靶向药物。因此寻找新的PHCC肿瘤标志物和治疗靶点迫在眉睫。Wnt信号通路是许多细胞基本生理过程(如增殖或分化)中必不可少且高度保守的分子信号机制。在许多类型的恶性肿瘤(如肝细胞癌、结肠直肠癌等)已观察到Wnt信号通路的异常激活。在经典Wnt信号通路中,TCF7/β-连环蛋白复合物是决定Wnt信号通路下游靶基因激活的关键效应复合物。转录因子7(transcription factor 7,TCF7)是TCF家族中的四个成员之一,通过与核β-连环蛋白结合,TCF7可促进Wnt信号转导从而激活靶基因(如c-myc、FOSL1等)的转录,从而促进恶性肿瘤的增值、侵袭等生物学行为。所以说,TCF7是Wnt信号通路中关键的“枢纽分子”。2015年Boulter等人发现,Wnt信号通路的激活可以促进ICC的发展,而TCF7在此过程中起关键作用。尽管TCF7参与了众多恶性肿瘤的发生与发展,但其在PHCC中的表达谱和功能尚未得到阐明。研究目的:1.筛选PHCC的关键肿瘤标志物,探索新的治疗靶点。2.明确TCF7在PHCC中的表达情况,比较TCF7表达情况对患者预后的影响。3.术后检测TCF7的表达从而对PHCC患者预后进行分层,指导术后个体化治疗和精准治疗,进而改善患者生存质量,延长患者生存时间。研究方法:1.收集病理诊断明确的新鲜PHCC及相应癌旁组织5对,委托北京奥维森基因科技有限公司进行转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq),获得差异基因表达谱,即候选肿瘤标志物。2.收集山东大学齐鲁医院在内的山东省内6家三级甲等医院自2012年1月至2015年12月接受PHCC根治性切除术患者的石蜡病理标本共计103例。制作组织芯片(tissue microarray,TMA),并行免疫组化(immunohistochemical,IHC)染色,验证TCF7在组织芯片中的表达情况。根据ROC曲线(receiver operating characteristic curve)计算得到cut-off值,进而将其分为TCF7低表达组(n=54例)和TCF7高表达组(n=49例)。3.通过对数秩检验(Log-rank test)进行单因素分析,获得TCF7表达情况与PHCC临床病理学因素的相关性比较。采用Cox回归模型进行因素分析,分析PHCC临床病理因素的独立预后意义。4.回顾性分析PHCC患者的临床资料,通过电话随访或实地调研等方法了解患者的生存状况。并且通过Kaplan-Meier法进行生存分析,从而明确TCF7表达水平对PHCC患者预后的影响。研究结果:1.通过转录组测序发现PHCC癌组织中TCF7的表达显著上调(p=0.026),表明TCF7在PHCC中具有促癌作用。2.与TCF7低表达组相比,TCF7高表达组在年龄、性别、TNM分期、神经侵犯以及有无胆道结石等方面无统计学差异(p>0.05);而TCF7高表达组中的肿瘤大小以及肿瘤分化程度与TCF7低表达组相比具有统计学差异(p<0.05),即TCF7高表达组肿瘤直径明显大于TCF7低表达组(χ2=5.127,p=0.024),分化程度普遍较低,而且肿瘤的恶性程度更高(χ2=5.352,p=0.021)。这表明TCF7参与了PHCC的肿瘤增殖过程。3.使用单因素和多因素分析评估TCF7表达水平与其临床病理学因素的预后价值。TCF7高表达患者3年生存率为59.0%,TCF7低表达患者3年生存率为23.0%,单因素分析具有统计学差异(p=0.019);无淋巴结转移患者(N0)3年生存率为46.2%,存在淋巴结转移患者(N1/N2)3年生存率为21.6%,单因素分析具有统计学差异(p=0.031);低TNM分期患者(Ⅰ/Ⅱ)3年生存率为36.4%,高TNM分期患者(Ⅲ/Ⅳ)3年生存率为30.1%,单因素分析具有统计学差异(p=0.014)。表明三者均与PHCC的不良预后相关。而年龄、肿瘤大小、分化程度、T分期、M分期、神经侵犯以及胆道结石并非PHCC预后的影响因素。除TNM分期外,将单因素分析中p<0.030的预后因素均纳入Cox回归模型进行多因素分析,结果表明TCF7为PHCC独立的预后生物标志物(p=0.024),而其他因素不能作为独立的预后因素(p>0.05)。4.通过Kaplan-Meier法行生存分析显示,与TCF7低表达的患者相比,TCF7高表达的PHCC患者具有更低的存活率(p=0.019)。表明TCF7的高表达影响PHCC患者的预后,使其总体生存率降低。结论:1.TCF7在PHCC肿瘤组织及癌旁组织中存在表达差异,在PHCC组织中普遍高表达,提示TCF7可促进PHCC的发生和发展。2.TCF7高表达的PHCC患者肿瘤直径明显大于低表达患者,且肿瘤分化程度普遍较低,恶性程度更高。3.TCF7表达、淋巴结转移以及临床TNM分期是影响PHCC患者预后的相关因素。TCF7高表达、淋巴结转移、高TNM分期提示预后不佳。4.TCF7是影响PHCC预后的独立因素,TCF7高表达的PHCC患者的预后较差,总体生存率显著低于TCF7低表达患者。