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现在抗癌的方式有很多种:手术治疗、放射治疗、化学治疗、生物治疗和中医治疗法。虽然方法有多种,但这些治疗法大部分都会在杀死癌细胞的同时将正常细胞杀死。目前生物治疗有细胞因子治疗、细胞转输治疗、自体细胞免疫治疗、癌疫苗治疗等技术。已有实验研究表明:使用苏云金芽胞杆菌治疗肿瘤时,水解后的苏云金芽胞杆菌产物可以区分出正常细胞而特异性的杀死癌细胞。本实验研究内容包括:第一,采集、分离和筛选四川达州生态区的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt),寻找新的Bt杀虫野生型菌株。第二,同源性分析表明,cryH1基因与抗癌细胞基因cry41Aa具有同源性且同源性为34%,;cryH2与杀癌细胞基因cry31具有同源性且同源性为31%,因此,推测这两个基因具有抗癌细胞活性。纯化CryH1和CryH2蛋白,通过MTT比色法检测CryH1与CryH2蛋白对癌细胞A549、H1299和Hela的抗癌作用。第三,用免疫磁珠分选法从外周血中获得树突状细胞前体CD14+细胞,诱导培养5 d后流式检测其为未成熟树突状细胞(dendritic cells,DC)。再用CryH1与CryH2蛋白刺激诱导未成熟树突状细胞3 d至其成熟,流式细胞仪检测细胞表型,分析结果。诱导培养小鼠骨髓细胞5 d,流式细胞仪检测小鼠未成熟树突状细胞表型。将纯化了的CryH1与CryH2蛋白用于刺激诱导未成熟树突状细胞成熟,作用时间为3d,流式检测结果。第四,免疫磁珠分选法从外周血中获得CD14-的T cells,加入提纯CryH1与CryH2蛋白培养后流式检测提纯Bt蛋白能否直接活化T cells。具体结论如下:1、样品的采集分离鉴定:于达州采集土样560份,分离出Bt菌株112株,出离率为20%。显微镜观察分离菌株的晶体形态,发现这112株Bt菌株晶体形态有菱形、方形、球形等,且大部分菌株对玉米螟和棉铃虫都具有杀虫活性;采用苏云金芽孢杆菌杀虫基因通用引物对分离的菌株进行PCR鉴定,鉴定表明分离菌株中cry1、cry2类基因类型最为丰富。因此,该地区的Bt菌株资源中含有的cry1、cry2基因较丰富。2、基因的信息分析:使用NCBI的Blastx对cryH1和cryH2的同源性进行比对分析,结果表明:cryH1的同源性与抗癌细胞活性基因cry41Aa(34%)及其他癌细胞活性基因都较高;cryH2的同源性与杀癌细胞基因cry31的同源性最高,为31%。CryH2蛋白分子量预测为90kDa,PI=6.42。提纯CryH2蛋白(pET28a-CryH2),终产物的纯度>85%,使用的缓冲液为20 mmoI/L磷酸钠,pH 7.4,含0.5%蔗糖保护剂。CryH1蛋白分子量预测为76kDa,PI=6.57。提纯CryH1蛋白(pET28a-CryH1),终产物的纯度>85%,使用20 mmol/L磷酸钠缓冲液溶解蛋白,pH 7.4,含0.5%蔗糖保护剂。3、癌细胞检测:用MTT比色法检测CryH1和CryH2蛋白对癌细胞A549、H1299和Hela的作用,处理24h后发现,CryH2蛋白对这三种癌细胞活性均具有抑制作用。4、外周血CD检测:用免疫磁珠分选法能成功从人的外周血中分选出DC前体CD14+单核细胞,用h-GMCSF和h-IL-4诱导培养可获得未成熟树突状细胞。流式检测细胞表型结果显示CryH1和CryH2蛋白能使树突状细胞表面CD83、CD11c表达上调,由此初步推断CryH1和CryH2蛋白可以诱导人的未成熟树突状细胞成熟。5、小鼠骨髓系细胞诱导培养:取小鼠骨髓系细胞诱导培养得到的单核细胞,用流式细胞仪检测结果,分析表明:诱导培养出的细胞与未成熟树突状细胞的表型相符合。在CryH1与CryH2蛋白浓度为100 μg/mL、10 μg/mL、1 μg/mL条件下刺激诱导小鼠髓系未成熟树突状细胞,3d可使MHC-Ⅱ分子表达水平提升约20%,使树突状细胞表面CD40分子表达水平也增强10%左右,其他表面标志分子表达水平基本相同。这些都说明CryH1与CryH2蛋白能诱导小鼠髓系树突状细胞成熟。6、T细胞检测:将CryH1与CryH2蛋白分别加入T(CD14-)细胞中培养3d,在CryH1与CryH2蛋白浓度为0.1、1、10 μg/mL时,流式细胞仪检测到细胞表面标志CD25表达量逐渐升高,CryH1检测结果与浓度为0.1、1、10 μg/mL分别对应的平均值为9.6、9.73和10.93(对照为8.07),CryH2分别对应的平均值为9.77、9.97、11.13(对照为8.07);而表面标志CD69表达无变化。CryH1的统计结果和对照相比,浓度为10 μg/mL时,P=0.0138,表明CryH1能使细胞表面标志CD25表达量显著升高。CryH2的统计结果和对照相比,浓度为10 μg/mL时,P=0.0129,表明CryH2能使细胞表面标志CD25表达量显著升高。综上可初步推断CryH1与CryH2蛋白可能具有活化T细胞的能力。