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再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)患者存在骨髓过度脂肪化、间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)成脂能力增强以及骨髓微环境中瘦素(leptin,LEP)积聚的特点。LEP是由肥胖基因编码、脂肪细胞合成并分泌的细胞因子样激素,通过与瘦素受体(leptin receptor,LEP-R)相结合而发挥多种生物学作用,如调节机体的食物摄入、能量消耗和脂肪存贮等。在骨髓微环境中脂肪细胞也能分泌LEP,并可作用于MSC,使其向成骨分化,同时抑制其向脂肪细胞分化。然而此作用在AA造血微环境中并未见发挥。由此推断在AA骨髓微环境中MSC存在对LEP失利用的现象,可能由于MSC表面瘦素受体(leptin receptor,LEP-R)被破坏,LEP不能被正常利用,导致MSC成脂分化能力增强、成骨分化能力减弱,从而产生骨髓过度脂肪化的结果。另外,LEP还具有活化淋巴细胞的免疫调节功能。AA患者骨髓微环境中不断积聚的LEP可活化T淋巴细胞,诱导其向Th1方向分化,此通路与免疫介导的AA发病机理一致。LEP对T淋巴细胞的活化,将AA的免疫异常扩大,继而加重MSC的免疫损伤,导致恶性循环,由此推断LEP在AA免疫异常及成脂、成骨紊乱过程中都起重要的作用,这可能是造成AA的免疫发病机制原因之一,也可能是免疫抑制剂治疗效果不良的原因之一。LEP的生成及活化T细胞是在AA发病过程中的重要环节,若能阻断LEP的合成或者拮抗其免疫调节作用则有望打断免疫紊乱的恶性循环,从而减轻AA的发生和发展程度。本研究通过对免疫介导LEP基因缺陷小鼠和正常小鼠AA模型进行体内、体外实验研究,在细胞、分子以及基因水平进行检测并比较两种小鼠模型之间及其与各自对照组之间的差异,以验证上述的LEP失利用和LEP扩大免疫信号的假说,通过LEP干预治疗阻断AA的免疫损伤进程,以期从造血微环境代谢层面为寻求AA治疗的新方法奠定基础。第一部分瘦素基因敲除对再生障碍性贫血小鼠模型造血的影响研究目的:将LEP缺陷的小鼠AA模型与正常小鼠AA模型分别与各自对照组小鼠进行比较,检测在发病过程中不同时间段小鼠的一般状态、骨髓衰竭情况和骨髓脂肪化程度。研究方法:1.采用免疫介导的方法分别建立LEP基因缺陷ob/ob小鼠(C57BL/6小鼠为建模基础,以下简称LEP缺陷小鼠)和正常C57BL/6小鼠(以下简称正常小鼠)的AA模型,分别用LEP缺陷C57BL/6小鼠和正常C57BL/6小鼠做对照;2.分别于造模后第0,3,6,9,12,15,18天观察小鼠的一般状态变化;3.分别于造模后第0,3,6,9,12,15,18天检测小鼠的血常规变化;4.分别于造模后第0,3,6,9,12,15,18天观察小鼠的骨髓病理形态学改变。对LEP缺陷小鼠模型和正常小鼠模型各时间段的上述各项指标进行统计学比较。结果:1.造模后正常小鼠逐渐出现进食量少、活动减少;皱毛、脱毛、弓背以及体质量下降等表现。而LEP缺陷小鼠造模后也出现上述表现,但其程度较正常小数模型组均明显减轻。2.LEP缺陷小鼠和正常小鼠造模后外周血白细胞(white blood cell,WBC)、红细胞(red white blood cell,RBC)、血红蛋白(hemoglobin,HB)、血小板(platelet,PLT)计数均迅速下降,差异有统计学意义(P<0.05);但LEP缺陷小鼠模型组的WBC、RBC、PLT下降幅度均比正常小鼠模型组小,血象最低值也较正常小鼠模型组高,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05);3.造模后正常小鼠模型组骨髓中正常的造血组织结构逐渐被破坏、造血细胞逐渐减少,脂肪组织取而代之;到+18d骨髓被大量的脂肪细胞填充。LEP缺陷的模型组小鼠也可见造血结构逐渐被破坏,+6天起骨髓表现增生减低,有少量脂肪细胞,造血面积减少,随后骨髓造血细胞逐渐减少,脂肪化程度逐渐加重,到+18d造血细胞被脂肪细胞部分取代,但较正常小鼠模型组造血组织结构破坏和脂肪化程度均减轻。结论:阻断LEP基因表达的小鼠AA模型骨髓脂肪化和骨髓衰竭程度均减轻,提示阻断LEP可能通过减轻骨髓脂肪化而改善骨髓造血功能;第二部分瘦素基因敲除对再生障碍性贫血小鼠模型造血影响的机制研究研究目的:将LEP缺陷的小鼠AA模型与正常小鼠AA模型分别与其各自对照组小鼠比较,检测在发病过程中不同时间段骨髓组织中成脂基因(C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ)和成骨基因(RUNx2)的表达情况;血清、骨髓以及MSC表面LEP-R表达水平的变化与差异;CD4~+T/CD8~+T比例倒置和Th1/Th2升高等免疫信号扩大化的情况。研究方法:1.采用免疫介导的方法分别建立LEP基因缺陷ob/ob小鼠(C57BL/6小鼠为建模基础,以下简称LEP缺陷小鼠)和正常C57BL/6小鼠(以下简称正常小鼠)的AA模型,分别用LEP缺陷C57BL/6小鼠和正常C57BL/6小鼠做对照;2.分别于造模后第0,3,6,9,12,15,18天用流式细胞术检测小鼠的外周血中CD4~+、CD8~+T细胞亚群的比例;3.分别于造模后第0,3,6,9,12,15,18天用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosobent assay,ELISA)检测小鼠血清中可溶性瘦素受体(soluble leptin receptor,sLEP-R)、Th1类细胞因子(IFN-γ、IL-2)、Th2类因子(IL-4、IL-5)的变化;4.分别于造模后第0,3,6,9,12,15,18天用免疫组化法检测小鼠骨髓组织中LEP-R的表达;5.分别于造模后第0,3,6,9,12,15,18天用实时荧光定量PCR方法检测小鼠骨髓组织中成脂基因(C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ)和成骨基因(RUNx2)的表达水平6.分离并培养小鼠MSC,分别于造模后第0,3,6,9,12,15,18天用实时荧光定量PCR方法检测小鼠骨髓MSC表面的LEP-R表达水平。对LEP缺陷小鼠模型和正常小鼠模型各时间段的上述各项指标进行统计学比较。结果:1.LEP缺陷小鼠模型组和正常小鼠模型组骨髓组织中成脂基因C/EBPα、C/EBPβ和PPARγ的表达均逐渐上升,差异有统计学意义(P<0.05);但LEP缺陷小鼠模型组成脂基因表达水平均比正常小鼠模型组低,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05);LEP缺陷小鼠模型组和正常小鼠模型组骨髓组织中骨基因RUNx2的表达逐渐下降,差异有统计学意义(P<0.05);但LEP缺陷小鼠模型组的成骨基因表达水平表达较正常小鼠模型组高,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05);2.LEP缺陷模型小鼠和正常模型小鼠造模后血清中sLEP-R水平均呈逐渐下降趋势,差异有统计学意义(P<0.05);但与正常小鼠模型组相比LEP缺陷小鼠模型组造模后的sLEP-R水平下降幅度小,表达水平也始终比正常小鼠模型组高,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05);LEP缺陷小鼠模型和正常小鼠模型骨髓组织中LEP-R的表达在造模后均呈逐渐下降趋势;但LEP缺陷小鼠模型下降程度较正常小鼠模型组明显减轻;LEP缺陷小鼠及正常小鼠在造模后MSC表面的LEP-R基因表达呈逐渐下降趋势,差异有统计学意义(P<0.05);但LEP缺陷小鼠模型组的下降幅度也较正常小鼠模型组小,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05);3.LEP缺陷模型组小鼠和正常小鼠造模后CD4~+T细胞值均低于其对照组,且呈逐渐下降趋势;差异有统计学意义(P<0.05);CD8~+T细胞值均高于其对照组,且呈逐渐上升趋势,差异有统计学意义(P<0.05);CD4~+T/CD8~+T比值也随之倒置,且呈现逐渐下降趋势,差异有统计学意义(P<0.05);但正常小鼠模型较LEP缺陷小鼠模型CD4~+T/CD8~+T比例倒置程度减轻,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05);4.LEP缺陷小鼠模型组和正常小鼠模型组造模后均出现Th1类细胞因子(IFN-γ、IL-2)逐渐升高,Th2类细胞因子(IL-4、IL-5)逐渐降低,差异有统计学意义(P<0.05);但LEP缺陷小鼠的模型组IFN-γ、IL-2升高和IL-4、IL-5降低的程度均较正常小鼠模型组轻,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.阻断LEP基因表达的小鼠AA模型成骨基因水平增高、成脂基因水平减低,MSC上的LEP-R减少,提示骨髓微环境中LEP的失利用导致骨髓过度脂肪化;2.在阻断LEP基因表达的AA小鼠模型中,Th1/Th2比例增高情况较正常小鼠AA模型减弱,提示LEP通过免疫瀑布效应加重AA的免疫异常,阻断LEP基因可能通过阻断免疫瀑布效应,减轻AA的发生和发展程度。3.本课题首次提出了LEP代谢紊乱引起AA骨髓成脂及免疫信号扩大化,因此,推测减少LEP基因表达、增加LEP-R水平或提高LEP-R与LEP结合的敏感性可能成为AA治疗的新思路和方法。