茶树SSR分子标记技术体系的建立与应用

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茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]是我国重要的经济作物之一,栽培历史悠久、分布广泛,种质资源极为丰富,但与其他重要经济作物相比,目前对茶树遗传基础的研究相对缺乏,在此方面的知识积累相对薄弱,尤其是对SSR标记技术的应用更是鲜见报道。本研究利用现有生物数据库中的茶树EST资源,开发SSR引物,并建立SSR标记技术体系,然后应用于茶树品种资源的遗传多样性分析。其主要结果如下:采用改进的DNA提取方法提取高质量的茶树基因组DNA,用已知浓度的Lambda DNA standard对所提DNA进行定量检测,建立了一种新的测定茶树基因组DNA浓度的方法。该法在国内发表的文献中还未见采用。通过对茶树SSR反应体系各因素进行优化,建立最适的反应条件为:反应总体积20μL,各成分的浓度或含量分别为1×Buffer,MgCl2 1.5~2.5 mmol/L,dNTPs 0.2mmol/L、引物各0.25μmol/L、Taq DNA聚合酶0.75 U,DNA模板用量30 ng。PCR扩增程序为95℃5 min;95℃1 min,各引物最佳温度退火45 s,72℃1 min,35个循环;72℃10 min。经多次扩增实践证明,该技术体系的重复性和稳定性良好。利用公共数据库(NCBI)中的茶树EST序列,采用Primer 3软件设计了33对SSR引物,并利用外文文献中发表的17对引物,共合成50对SSR引物对茶树基因组DNA进行扩增,有37对引物获得了扩增产物,其可扩增率为74%。用37对可扩增引物对43个茶树品种(系)扩增,经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,其中有34对引物产生多态性,不同引物扩增带数分布在1~11条之间,扩增片段大小介于150~350 bp。从34对可扩增引物中选择16对扩增43个茶树品种(系),首次采用毛细管电泳检测其扩增产物,共获得142个等位变异。应用DPS软件,进行遗传距离和相似性系数计算,43份材料遗传距离的变化范围在0.059~0.820之间,说明供试茶树资源间的遗传变异十分宽广。根据UPGMA法构建聚类树状图,在平均遗传距离水平上,可将43份材料划分为7个类群,大部分具有相近系谱的品种(系)被聚在一起。可见,SSR分子标记技术能较好地揭示品种资源间的亲缘关系。利用非变性聚丙烯酰胺凝胶银染技术和毛细管电泳检测方法对供试茶树品种(系)不同引物的扩增产物进行检测,初步建立了43个供试材料在34个SSR位点的指纹,为构建我国茶树种质的SSR基因型数据库奠定了方法学基础。本论文研究的开展,将加速茶树EST资源的开发利用与SSR标记技术在茶树遗传研究领域的应用,对茶树饱和遗传图谱构建、起源演化研究与系统分类、品种与种质鉴别、特定性状的分子标记辅助选择育种等方面都具有一定的应用价值与推动意义。
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