文昌鱼解偶联蛋白的分子克隆以及利用点突变的方法研究UCP1解偶联功能与结构之间的关系

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解偶联蛋白(UCPs)属于线粒体阴离子载体超家族,由电子传递产生的线粒体膜电势通过解偶联蛋白转化为热能。在哺乳动物中,目前发现了五种解偶联蛋白异构体,UCP1-UCP5。UCP1主要表达在人类新生儿、小型哺乳动物以及冬眠动物的褐色脂肪组织(BAT)中,可以通过催化质子渗漏行使非颤抖性产热功能。UCP2和UCP3在组织中广泛表达,在特定的条件下,可以降低ROS的产生,除此之外,其生理功能仍然存在着广泛争议。UCP4和UCP5特异性的表达于大脑中,并未表现出典型的与UCP1相似的生化特性,在系统发生上也不同于核心的UCP蛋白。尽管生物信息学研究表面在非脊椎动物中也存在解偶联蛋白,但目前只在脊椎动物中发现解偶联蛋白,而非脊椎动物解偶联蛋白的存在还缺乏实验依据。本文阐述了通过分子克隆的方法,在厦门文昌鱼(Branchiostoma belcheri)中发现了一段全新的cDNA片段。这段cDNA编码一个长度为343个氨基酸的蛋白,与哺乳动物的解偶联蛋白(UCP)高度同源,因此命名为anphioxus UCP(文昌鱼解偶联蛋白)。为了进一步检测amphioxus UCP与哺乳动物UCP1以及UCP2在功能上的相识性,将amphioxus UCP、大鼠UCP1以及人类UCP2分别在酿酒酵母中表达,提取酵母线粒体,并检测state4的呼吸速率以及解偶联率。UCP1的state4乎吸速率提高了2.8倍,并且GDP可以强烈的抑制其解偶联活性;同时UCP2和amphioxus UCP的state4呼吸速率仅提高了1.5和1.7倍,解偶联活性也不能被GDP所调节。而且amphioxus UCP的质子渗漏曲线与UCP2更为相识,与UCP1差异较大。综上所述,amphioxus UCP在酵母表达系统中表现出一种温和的、不受GDP调控的解偶联活性,这与哺乳动物的UCP2更为相似,而不是UCP1。通过对文昌鱼UCP功能的研究,我们推测所有的UCPs在进化上可能都来自同一祖先基因。进化的过程中,基因组通过基因扩增的方法产生了UCP1、UCP2.和UCP3。利用三个数据库查,阅筛选了73条UCP蛋白质以及核苷酸序列,通过生物信息学对UCPs家族进行系统进化分析,发现UCP1在哺乳动物后兽向真兽进化的过程中,存在着进化加速的现象。并根据这一推测,通过点突变以及酵母异源表达的系统来研究UCP1解偶联功能与结构的关系,最终发现了6个与UCP1解偶联功能相关的位点,也从侧面证明了UCP1进化加速的理论。
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