【摘 要】
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研究目的:探明PD-L1调控M2型TAM(TAm/M2)极化在TNBC转移及血管形成过程中的作用及可能的分子机制,为PD-L1作为TNBC抗肿瘤转移的靶点提供新的理论和实验依据。材料方法:1.采用流式细胞术、Western blot、免疫荧光法检测TAM/M2表面标志物CD206、M1型TAM(TAM/M1)表面标志物CD86的表达情况;ELISA法检测TAM/M2标志性细胞因子IL-10及TAM
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研究目的:探明PD-L1调控M2型TAM(TAm/M2)极化在TNBC转移及血管形成过程中的作用及可能的分子机制,为PD-L1作为TNBC抗肿瘤转移的靶点提供新的理论和实验依据。材料方法:1.采用流式细胞术、Western blot、免疫荧光法检测TAM/M2表面标志物CD206、M1型TAM(TAM/M1)表面标志物CD86的表达情况;ELISA法检测TAM/M2标志性细胞因子IL-10及TAM/M1标志性细胞因子IL-12的分泌情况。2.制备IL-13与αPD-Ll(PD-L1抑制剂)单独或共同孵育巨噬细胞的条件培养基备用。3.采用MTT、流式细胞术检测αPD-L1对巨噬细胞增殖和凋亡的影响及条件培养基对TNBC细胞的影响。4.条件培养基处理TNBC细胞,通过细胞划痕、Transwell实验检测其侵袭及迁移能力。5.条件培养基处理HUVEC细胞,通过微血管形成实验检测血管形成能力。6.条件培养基处理TNBC细胞,通过Western blot实验检测VEGF、MMP2的表达情况。7.TNBC细胞与巨噬细胞共培养,通过流式细胞术、Western blot检测CD206及CD86的表达情况;ELISA法检测IL-10及IL-12的分泌情况。8.采用Western blot、免疫荧光实验检测STAT3信号通路蛋白表达变化及蛋白在细胞内的定位情况。结果:1.αPD-L1逆转TAM/M2极化:IL-13可诱导RAW264.7细胞M2型极化,αPD-L1 逆转 TAMM2 极化,对 TAM/M1 无影响;2.αPD-L1 抑制 TAM/M2 诱导的TNBC细胞侵袭及迁移:IL-13诱导的RAW264.7条件培养基显著促进TNBC细胞的侵袭及迁移能力,αPD-L1可抑制其侵袭及迁移。3.αPD-L1抑制TAM/M2诱导的TNBC血管形成:IL-13诱导的RAW264.7条件培养基显著促进HUVEC的管腔形成,而αPD-L1可抑制HUVEC的管腔形成;IL-13诱导的RAW264.7条件培养基显著上调TNBC细胞VEGF、MMP2的表达,αPD-L1可下调TNBC细胞VEGF、MMP2的表达;4.TNBC细胞诱导TAM/M2极化,正反馈促进TNBC细胞的恶性演进:将TNBC与RAW264.7细胞间接共培养,结果表明TNBC细胞可显著促进RAW264.7细胞TAM/M2极化,而αPD-L1可逆转这种极化。TAM/M1的极化不受RAW264.7共培养及αPD-L1的影响;5.αPD-L1通过抑制RAW264.7细胞STAT3磷酸化阻止其入核,调控TAM/M2极化:IL-13可显著促进RAW264.7细胞p-STAT3的表达水平,而给予αPD-L1后,p-STAT3的表达水平显著抑制;αPD-L1可阻止IL-13诱导的STAT3磷酸化及p-STAT3入核。结论:1.αPD-L1逆转TNBC细胞诱导的TAM/M2极化。2.αPD-L1抑制TAM/M2极化诱导的TNBC细胞侵袭、迁移及血管形成。3.αPD-L1通过抑制STAT3磷酸化,阻止其入核调控TAM/M2极化。
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