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目的：
利用去氧乙烯基环己烯(4-vinylcyelonhexene diepoxide，VCD)构造大鼠的早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency)疾病模型，探讨护阳养坤方通过调节水通道蛋白(aquaporins，AQPs)和细胞凋亡信号分子通路(Fas，TNF)以及Bcl-2线粒体通路的表达，从而保护并改善POI卵巢功能的作用机制。
方法：
实验一：护阳养坤方对VCD诱导的早发性卵巢功能不全模型大鼠的卵巢功能的保护作用
将SPF级雌性SD大鼠，采用随机数字表法随机分为五组：正常对照组(NCN)、佐剂对照组(SCN)、模型组(MOD)、护阳养坤方干预组(HYF)、和戊酸雌二醇干预组(EVT)。
实验二：水通道蛋白参与的护阳养坤方保护POI模型大鼠卵巢功能的机制研究
从实验二中取材得到正常对照组、模型组、护阳养坤方组和戊酸雌二醇组大鼠的卵巢组织。将部分卵巢组织进行病理切片和TUNEL染色，观察大鼠卵巢切片细胞凋亡情况。取部分卵巢组织提取总蛋白，采用Western-Blot方法检测卵巢中细胞经典凋亡通路Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Bax、Bak、BID、Bim、FAS、FASL、TNFR1以及NFκB(P65)、P-PB5，水通道蛋白AQP1、AQP5和AQP8等蛋白的表达情况。将部分卵巢组织进行病理切片和免疫组化染色，并在光镜下观察各组间AQP1、AQP5、AQP8和AQP9的蛋白表达，并拍片进行定量分析。综合各项指标结果探讨护阳养坤方对VCD诱导的早发性卵巢功能不全疗效的机制研究。
结果：
实验一：护阳养坤方对VCD诱导的早发性卵巢功能不全模型大鼠的卵巢功能的保护作用
1.大鼠血清肝肾功水平变化：大鼠血清ALT、AST、ALT/AST、BUN和Cr等数值的分析结果显示各组数值之间没有统计学差异(P值分别为0.064，0.278，0.643，0.626和0.134，均大于0.05)。2.大鼠卵巢脏器系数：大鼠卵巢脏器系数数值的分析结果显示各组均数的差异有显著性差异(F=2.95l，P=0.035，P＜0.05)，差异主要体现在佐剂对照组与模型组之间(P=0.021，P＜0.05)。3.大鼠卵巢体积及平均卵巢面积的变化：对大鼠卵巢体积的分析结果显示各组均数存在显著性差异(F=3.726，P=0.009，P＜0.01)。其中，与正常对照组相比，模型组大鼠卵巢体积较小，但该差异无统计学意义;与模型组相比，护阳养坤方组大鼠卵巢体积明显增加，差异显著(P=0.028，P＜0.05)。大鼠平均卵巢面积指标的各组多个均数的比较结果显示存在显著性差异(F=3.914，P=0.007，P＜0.01)。其中，与正常对照组相比，模型组大鼠平均卵巢面积较小;与模型组相比，护阳养坤方组大鼠平均卵巢面积增大，但均无统计学意义。4.大鼠卵巢组织形态变化：在光镜下观察可见，正常对照组大鼠卵巢组织皮质内可见不同发育阶段的卵泡，髓质内血管丰富;佐剂对照组卵巢组织内同样可以观察到不同发育阶段的卵泡及丰富的血管;模型组的卵巢组织则出现不同程度的萎缩，发育阶段的卵泡数目明显减少;护阳养坤方干预组的卵巢组织可以观察到不同发育阶段的卵泡及丰富的血管;戊酸雌二醇干预组的卵巢组织可见一定程度的萎缩，发育阶段的卵泡数目较少。5.大鼠卵巢各级卵泡计数情况：始基卵泡数值的分析结果显示各组数值之间有极显著性差异(H=17.044，P=0.002，P＜0.01)。与正常对照组相比较，模型组的始基卵泡数目减少;与模型组相比，护阳养坤方组的始基卵泡数目增加。其中，戊酸雌二醇组与正常对照组和佐剂对照组相比，始基卵泡数减少明显(P值分别为0.008和0.028，P＜0.05)。初级卵泡数值的分析结果显示各组数值之间没有显著性差异(F=0.778，P=0.564，P＞0.05)。次级卵泡数值的分析结果显示各组数值之间没有显著性差异(F=3.189，P=0.070，P＞0.05)。窦卵泡数值的分析结果显示各组数值之间有极显著性差异(F=25.308，P=0.000，P＜0.01)。其中，模型组与正常对照组和佐剂对照组相比，窦卵泡数减少明显(P值均小于0.01)。总卵泡数的分析结果显示各组数值之间有极显著性差异(F=11.688，P=0.000，P＜0.01)。其中，模型组与正常对照组和佐剂对照组相比，总卵泡数减少明显(P值均小于0.01)。与与模型组相比，护阳养坤方组的总卵泡数目增加，有湿著性差异(P=0.045，P＜0.05)。6.人鼠了似脏器系数：人鼠予似脏器系数数仇的分析结果显示各组数值之间没有统汁学差异(H=4.619，P=0.329，P＞0.05)。7.大鼠子宫组织的病理学变化：观察比较不同组别子宫组织病理切片，结果发现从子宫内膜厚度、固有层内腺体数晕和腺腔人小等指标比较，各组之间没有肉眼可见的差异。但是相较于其他组，戊酸雌二醇组的子宫肌层和外膜则较为致密。8.人鼠血清激素水平检测：大鼠血清AMH数值的分析结果％示各组数值之间有统计学差异(H=13.307，P=-0.010，P＜0.05)，与正常对照组相比较，模型组的AMH水平降低;与模型组相比，护阳养坤方组的AMH明显回升，具有统计学差异差异(P=0.011，P＜0.05)。大鼠血清E2数值的分析结果显示各组数值之间有统计学差异(H=16.254，P=0.003，P＜0.01)，其中模型组与正常对照组相比、戊酸雌二醇组与模型组相比有显著性差异(P值分别为0.042和0.010，均小于0.05)。
实验二：水通道蛋白参与的护阳养坤方保护POI模型人鼠卵巢功能的机制研究
1.大鼠卵巢切片TUNEL染色结果分析：正常对照组中有不同发育阶段的卵泡，卵巢中有散在的少量凋亡信号;模型组中卵泡数较少，检测到较多凋亡信号;护阳养坤方组也见到不同发育阶段的卵泡，卵巢中偶见凋亡信号;戊酸雌二醇组中发育的卵泡较少，可观察到较少凋亡信号。2.细胞凋亡的死亡受体途径中，大鼠卵巢FAS，FASL，TNFRl，NFκB(P65)和P-P65等蛋白表达多组比较均没有显著性差异。3.细胞凋亡的线粒体通路中Bcl-2家族蛋白的表达：Bcl-XL指标的各组数值单因素方差分析结果显示各组数值之间有显著性差异(F=9.496，P=0.005，P＜0.01)。与正常对照组相比，模型组的蛋白表达升高，且具有显著性差异(P=0.00l，P＜0.01);与模型组相比，护阳养坤方组和戊酸雌二醇组的Bcl-XL蛋白表达量均减少，且P值分别是0.007和0.011，均小于0.05，护阳养坤方组的差异比戊酸雌二醇组的差异更显著，P值小于0.0l。Mcl-1指标的各组数值单因素方养分析结果显示各组数值之间有显著性差异(F=26.480，P=0.000，P＜0.01)。与正常对照组相比，模型组的蛋白表达升高，且具有显著性差异(P=0.000，P＜0.01)。与模型组相比，护阳养坤方组和戊酸雌二醇组的Mcl-1蛋白表达量均减少，且都具显著性差异(P值分别是0.000和0.000，均小于0.01)。Bak指标的各组数值Welch’s方差分析结果显示各组数值之间有显著性差异(F=10.751，P=0.024，P＜0.05)。与正常对照组相比，模型组的蛋白表达升高，但没有显著性差异。与模型组相比，护阳养坤方组和戊酸雌二醇组的Bak蛋白表达量均减少，其中护阳养坤方组的具有显著性差异(P=0.043，P＜0.05)。4.大鼠卵巢内水通道蛋白的WB检测分析：AQP8符组数值分析显示，模型组AQP8的蛋白表达较正常组升高，与模型组相比，护阳养坤方组和戊酸雌二醇组的AQP8蛋白表达量均减少，但是单因素方差分析结果显示各组数值之间没有显著性差异（F=2.808，P=0.108，P＞0.05)。5.人鼠卵巢水通道蛋白的IHC检测分析：AQP1各组数值的Welch’s方差分析结果显示各组数值之间有显著性差异(F=8.027，P=0.000，P＜0.01)。用Galnes-Howell法进行两两比较发现，与正常组和模型组相比，护阳养坤方组AQP1蛋白表达量均显著减少(P值为0.003，小于0.01)，说明护阳养坤方对AQP1的表达影响显著。AQP5各组数值的Kruskal-Wallis检验结果显示各组数值之间有显著性差异(H=9.267，P=0.026，P＜0.05)。分析显示，与正常对照组相比，模型组AQP5的蛋白表达升高：与模型组相比，护阳养坤方组的AQP5蛋白表达量减少。AQP8各组数值的Kruskal-Wet]lis检验结果显示各组数值之间有显著性差异(F=17.076，P=0.001，P＜0.01)。分析显示，与正常对照组相比，模型组AQP8的蛋白表达显著升高，且具有显著性差异(P=0.001，P＜0.01)。与模型组相比，护阳养坤方组的AQP8蛋白表达量减少，且具有显著性差异(P=0.01，P＜0.05)。
结论：
1.用VCD诱导早发性卵巢功能不全SD大鼠模型的造模方法可行;2.护阳养坤方可提高POI大鼠的血清AMH水平，促进其卵泡发育，对卵巢有保护作用;3.护阳养坤方调控了卵巢中细胞凋亡通路尤其是Bcl-2家族的表达;4.护阳养坤方降低了VCD导致的AQPs过度表达;5.AQPs的表达与细胞凋亡通路之间存在一定的联系，护阳养帅方可能是通过AQPs表达减少，调节细胞凋亡通路的表达，减缓了卵泡的闭锁，使得更多卵泡能够发育成熟。
利用去氧乙烯基环己烯(4-vinylcyelonhexene diepoxide，VCD)构造大鼠的早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency)疾病模型，探讨护阳养坤方通过调节水通道蛋白(aquaporins，AQPs)和细胞凋亡信号分子通路(Fas，TNF)以及Bcl-2线粒体通路的表达，从而保护并改善POI卵巢功能的作用机制。
方法：
实验一：护阳养坤方对VCD诱导的早发性卵巢功能不全模型大鼠的卵巢功能的保护作用
将SPF级雌性SD大鼠，采用随机数字表法随机分为五组：正常对照组(NCN)、佐剂对照组(SCN)、模型组(MOD)、护阳养坤方干预组(HYF)、和戊酸雌二醇干预组(EVT)。
实验二：水通道蛋白参与的护阳养坤方保护POI模型大鼠卵巢功能的机制研究
从实验二中取材得到正常对照组、模型组、护阳养坤方组和戊酸雌二醇组大鼠的卵巢组织。将部分卵巢组织进行病理切片和TUNEL染色，观察大鼠卵巢切片细胞凋亡情况。取部分卵巢组织提取总蛋白，采用Western-Blot方法检测卵巢中细胞经典凋亡通路Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Bax、Bak、BID、Bim、FAS、FASL、TNFR1以及NFκB(P65)、P-PB5，水通道蛋白AQP1、AQP5和AQP8等蛋白的表达情况。将部分卵巢组织进行病理切片和免疫组化染色，并在光镜下观察各组间AQP1、AQP5、AQP8和AQP9的蛋白表达，并拍片进行定量分析。综合各项指标结果探讨护阳养坤方对VCD诱导的早发性卵巢功能不全疗效的机制研究。
结果：
实验一：护阳养坤方对VCD诱导的早发性卵巢功能不全模型大鼠的卵巢功能的保护作用
1.大鼠血清肝肾功水平变化：大鼠血清ALT、AST、ALT/AST、BUN和Cr等数值的分析结果显示各组数值之间没有统计学差异(P值分别为0.064，0.278，0.643，0.626和0.134，均大于0.05)。2.大鼠卵巢脏器系数：大鼠卵巢脏器系数数值的分析结果显示各组均数的差异有显著性差异(F=2.95l，P=0.035，P＜0.05)，差异主要体现在佐剂对照组与模型组之间(P=0.021，P＜0.05)。3.大鼠卵巢体积及平均卵巢面积的变化：对大鼠卵巢体积的分析结果显示各组均数存在显著性差异(F=3.726，P=0.009，P＜0.01)。其中，与正常对照组相比，模型组大鼠卵巢体积较小，但该差异无统计学意义;与模型组相比，护阳养坤方组大鼠卵巢体积明显增加，差异显著(P=0.028，P＜0.05)。大鼠平均卵巢面积指标的各组多个均数的比较结果显示存在显著性差异(F=3.914，P=0.007，P＜0.01)。其中，与正常对照组相比，模型组大鼠平均卵巢面积较小;与模型组相比，护阳养坤方组大鼠平均卵巢面积增大，但均无统计学意义。4.大鼠卵巢组织形态变化：在光镜下观察可见，正常对照组大鼠卵巢组织皮质内可见不同发育阶段的卵泡，髓质内血管丰富;佐剂对照组卵巢组织内同样可以观察到不同发育阶段的卵泡及丰富的血管;模型组的卵巢组织则出现不同程度的萎缩，发育阶段的卵泡数目明显减少;护阳养坤方干预组的卵巢组织可以观察到不同发育阶段的卵泡及丰富的血管;戊酸雌二醇干预组的卵巢组织可见一定程度的萎缩，发育阶段的卵泡数目较少。5.大鼠卵巢各级卵泡计数情况：始基卵泡数值的分析结果显示各组数值之间有极显著性差异(H=17.044，P=0.002，P＜0.01)。与正常对照组相比较，模型组的始基卵泡数目减少;与模型组相比，护阳养坤方组的始基卵泡数目增加。其中，戊酸雌二醇组与正常对照组和佐剂对照组相比，始基卵泡数减少明显(P值分别为0.008和0.028，P＜0.05)。初级卵泡数值的分析结果显示各组数值之间没有显著性差异(F=0.778，P=0.564，P＞0.05)。次级卵泡数值的分析结果显示各组数值之间没有显著性差异(F=3.189，P=0.070，P＞0.05)。窦卵泡数值的分析结果显示各组数值之间有极显著性差异(F=25.308，P=0.000，P＜0.01)。其中，模型组与正常对照组和佐剂对照组相比，窦卵泡数减少明显(P值均小于0.01)。总卵泡数的分析结果显示各组数值之间有极显著性差异(F=11.688，P=0.000，P＜0.01)。其中，模型组与正常对照组和佐剂对照组相比，总卵泡数减少明显(P值均小于0.01)。与与模型组相比，护阳养坤方组的总卵泡数目增加，有湿著性差异(P=0.045，P＜0.05)。6.人鼠了似脏器系数：人鼠予似脏器系数数仇的分析结果显示各组数值之间没有统汁学差异(H=4.619，P=0.329，P＞0.05)。7.大鼠子宫组织的病理学变化：观察比较不同组别子宫组织病理切片，结果发现从子宫内膜厚度、固有层内腺体数晕和腺腔人小等指标比较，各组之间没有肉眼可见的差异。但是相较于其他组，戊酸雌二醇组的子宫肌层和外膜则较为致密。8.人鼠血清激素水平检测：大鼠血清AMH数值的分析结果％示各组数值之间有统计学差异(H=13.307，P=-0.010，P＜0.05)，与正常对照组相比较，模型组的AMH水平降低;与模型组相比，护阳养坤方组的AMH明显回升，具有统计学差异差异(P=0.011，P＜0.05)。大鼠血清E2数值的分析结果显示各组数值之间有统计学差异(H=16.254，P=0.003，P＜0.01)，其中模型组与正常对照组相比、戊酸雌二醇组与模型组相比有显著性差异(P值分别为0.042和0.010，均小于0.05)。
实验二：水通道蛋白参与的护阳养坤方保护POI模型人鼠卵巢功能的机制研究
1.大鼠卵巢切片TUNEL染色结果分析：正常对照组中有不同发育阶段的卵泡，卵巢中有散在的少量凋亡信号;模型组中卵泡数较少，检测到较多凋亡信号;护阳养坤方组也见到不同发育阶段的卵泡，卵巢中偶见凋亡信号;戊酸雌二醇组中发育的卵泡较少，可观察到较少凋亡信号。2.细胞凋亡的死亡受体途径中，大鼠卵巢FAS，FASL，TNFRl，NFκB(P65)和P-P65等蛋白表达多组比较均没有显著性差异。3.细胞凋亡的线粒体通路中Bcl-2家族蛋白的表达：Bcl-XL指标的各组数值单因素方差分析结果显示各组数值之间有显著性差异(F=9.496，P=0.005，P＜0.01)。与正常对照组相比，模型组的蛋白表达升高，且具有显著性差异(P=0.00l，P＜0.01);与模型组相比，护阳养坤方组和戊酸雌二醇组的Bcl-XL蛋白表达量均减少，且P值分别是0.007和0.011，均小于0.05，护阳养坤方组的差异比戊酸雌二醇组的差异更显著，P值小于0.0l。Mcl-1指标的各组数值单因素方养分析结果显示各组数值之间有显著性差异(F=26.480，P=0.000，P＜0.01)。与正常对照组相比，模型组的蛋白表达升高，且具有显著性差异(P=0.000，P＜0.01)。与模型组相比，护阳养坤方组和戊酸雌二醇组的Mcl-1蛋白表达量均减少，且都具显著性差异(P值分别是0.000和0.000，均小于0.01)。Bak指标的各组数值Welch’s方差分析结果显示各组数值之间有显著性差异(F=10.751，P=0.024，P＜0.05)。与正常对照组相比，模型组的蛋白表达升高，但没有显著性差异。与模型组相比，护阳养坤方组和戊酸雌二醇组的Bak蛋白表达量均减少，其中护阳养坤方组的具有显著性差异(P=0.043，P＜0.05)。4.大鼠卵巢内水通道蛋白的WB检测分析：AQP8符组数值分析显示，模型组AQP8的蛋白表达较正常组升高，与模型组相比，护阳养坤方组和戊酸雌二醇组的AQP8蛋白表达量均减少，但是单因素方差分析结果显示各组数值之间没有显著性差异（F=2.808，P=0.108，P＞0.05)。5.人鼠卵巢水通道蛋白的IHC检测分析：AQP1各组数值的Welch’s方差分析结果显示各组数值之间有显著性差异(F=8.027，P=0.000，P＜0.01)。用Galnes-Howell法进行两两比较发现，与正常组和模型组相比，护阳养坤方组AQP1蛋白表达量均显著减少(P值为0.003，小于0.01)，说明护阳养坤方对AQP1的表达影响显著。AQP5各组数值的Kruskal-Wallis检验结果显示各组数值之间有显著性差异(H=9.267，P=0.026，P＜0.05)。分析显示，与正常对照组相比，模型组AQP5的蛋白表达升高：与模型组相比，护阳养坤方组的AQP5蛋白表达量减少。AQP8各组数值的Kruskal-Wet]lis检验结果显示各组数值之间有显著性差异(F=17.076，P=0.001，P＜0.01)。分析显示，与正常对照组相比，模型组AQP8的蛋白表达显著升高，且具有显著性差异(P=0.001，P＜0.01)。与模型组相比，护阳养坤方组的AQP8蛋白表达量减少，且具有显著性差异(P=0.01，P＜0.05)。
结论：
1.用VCD诱导早发性卵巢功能不全SD大鼠模型的造模方法可行;2.护阳养坤方可提高POI大鼠的血清AMH水平，促进其卵泡发育，对卵巢有保护作用;3.护阳养坤方调控了卵巢中细胞凋亡通路尤其是Bcl-2家族的表达;4.护阳养坤方降低了VCD导致的AQPs过度表达;5.AQPs的表达与细胞凋亡通路之间存在一定的联系，护阳养帅方可能是通过AQPs表达减少，调节细胞凋亡通路的表达，减缓了卵泡的闭锁，使得更多卵泡能够发育成熟。