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研究背景:
炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一种非特异性炎症性肠道疾病，主要包括克罗恩病(Crohns disease，CD)和溃疡性炎症性肠病(Ulcerative colitis，UC)两种疾病形式，此病在欧美国家多发，截至2015年，美国IBD患者数量已超过100万，欧洲超过250万，欧美等发达国家IBD发病率高达0.5％。近十年发现，亚洲、中东及南美等地区的新兴工业化国家IBD发病率也持续增加。由于新兴工业化国家发病率及人口总量急剧增长，预测至2025年，IBD患者总量将与西方国家人口总量相持平，IBD将成为新的全球性负担。IBD多发病于青壮年时期，致病因素尚不明确，多认为与易感基因突变、环境的改变、肠道菌群失衡及免疫应答异常等有关，致病因素的不确定性及多样性加剧了IBD的治疗难度，其中免疫功能紊乱及免疫应答异常，被认为是引起IBD发病的主要因素，也是靶向治疗IBD的主要目标。
树突状细胞(Dendritic cells，DC)是功能最强大的专职抗原提呈细胞(Antigen presenting cell，APC)，是连接固有免疫和适应性免疫的“桥梁”，通过自身耐受性及分泌的特异性细胞因子的不同，调控CD4+T细胞分化为不同的辅助T细胞(T helper cells，Th)或调节性T细胞(Regulatory cells，Treg)，使免疫系统发挥免疫激活或免疫耐受作用，进而参与包括IBD在内的多种自身免疫性疾病的发生与发展。CD4+T细胞主要由Th细胞亚群和Treg细胞亚群组成，IBD患者结肠组织往往伴随大量CD4+T细胞的浸润，最初认为Th1/Th2细胞分化失衡是介导IBD发病的主要机制，Th1细胞的过度活化使促炎因子IFN-γ大量表达，抑制IL-4依赖性的Th2细胞的分化，使Th1/Th2细胞轴产生严重偏移，加剧炎症反应，进而在IBD中发挥致病作用。随着IL-17分泌性Th17细胞亚群在IBD患者中检出，Th17细胞在IBD中的致病作用被逐步确定，补充了Th1/Th2细胞失衡致病的理论。Th17细胞通过分泌促炎因子IL-17参与炎症反应，介导剧烈的组织损伤，其分化呈IL-6依赖性。IL-6抑制TGF-β依赖性亚群Treg细胞的分化，Treg细胞数量不足或功能受损也是IBD发病的机制之一，因此Th17/Treg细胞的分化失衡，成为介导IBD的新型机制，并被广泛探究。
目前，IBD的治疗方案主要集中在药物治疗，主要包括氨基水杨酸类药物、皮质类固醇类药物、免疫抑制剂、单抗药物，及其他选择性药物如抗生素、益生菌、维生素及罗格列酮等。随着细胞分子医学及免疫学的深入研究，更多的IBD机制及药物靶点被发现，使IBD的治疗药物及治疗方式呈现多元化开发。然而目前IBD仍然难以被根治，复发率极高，且治疗药物价格昂贵、用药周期长、不良反应等因素，促使研究人员不断探索新的安全、高效、平价的IBD治疗药物或治疗手段。
研究目的:
桦褐孔菌又称白桦茸，是生长于白桦、银桦、榆树、赤杨等树皮下的一种可食用真菌，多分布于北纬40-50°的寒冷地带，如我国黑龙江省、吉林省长白山等地区，欧洲国家早在16世纪便利用其治疗恶性肿瘤、糖尿病、炎症等难治性疾病。桦褐孔菌多糖(Inonotus obliquus polysaccharide，IOP)是由桦褐孔菌提取的最具有药用价值的活性成分之一，具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节、降血糖、降血脂等多种生物活性，但其对葡聚糖硫酸钠(Dextran sulphate sodium，DSS)诱导的实验性结肠炎的治疗作用及相关机制尚不明确。因此本研究采用不同浓度的IOP探索其对DSS诱导的急、慢性结肠炎的治疗作用，并探索其与DC及CD4+T细胞相关的治疗机制，为IOP治疗IBD提供可行性及理论依据，并通过IOP诱导的耐受性骨髓来源树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cells，BMDC)的体内回输，为IBD免疫细胞治疗提供新的可能性。
第一部分IOP对DSS诱导的慢性炎症性肠病的治疗作用
研究方法:
采用热水浸提法提取IOP，并采用高效液相检测IOP的单糖组成。BALB/c雄性6-8周龄小鼠给予3％DSS三次循环共43天造模法建立慢性结肠炎模型，实验组给予三种不同浓度IOP(100，200，300 mg/kg)处理，每日检测小鼠体重、粪便性状、便血情况，并进行疾病活动指数(Disease active index，DAI)评分。第44天脱颈法处死小鼠，测量小鼠结肠长度，评估小鼠肠道炎症严重程度。小鼠结肠石蜡切片进行苏木素-伊红染色(Hematoxylin-Eosin staining，HE)染色并进行组织学评分，免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)法检测小鼠结肠组织中带状闭合蛋白(Zonula occludens-1 protein，ZO-1)、Occludin这两种紧密连接(Tight junction，TJ)蛋白的表达，观察小鼠结肠组织完整性及黏膜损伤情况;逆转录-聚合链酶反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)法检测小鼠结肠组织中与Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Treg细胞相关的特异性细胞因子及转录因子的基因水平表达情况。流式细胞术检测小鼠脾脏及肠系膜淋巴结(Mesenteric lymph node，MLN)中Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Treg细胞的分化情况。IHC及免疫印迹(Western blot，WB)法检测与CD4+T细胞分化相关的JAK-STAT信号通路相关蛋白STAT1、STAT3、STAT6在结肠组织中的表达情况。
研究结果:
经高效液相法检测，我们所提取的IOP主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖组成，含量分别为9.2％、4.4％、46.6％、11.5％、11.1％、4.3％。糖度仪检测多糖含量大于90％，适用于后续研究。与模型组相比，IOP(100，200，300 mg/kg)治疗组小鼠体重变化率较小，结肠长度明显恢复，DAI及组织学评分显著降低，肠道炎症情况得到明显改善，结肠组织TJ蛋白ZO-1及Occludin丢失较少，显著保护了结肠组织通透性及完整性。RT-PCR结果显示，IOP(100，200，300 mg/kg)使结肠组织中Th1细胞、Th17细胞相关促炎因子IFN-γ、IL-17及特异性转录因子T-bet、ROR-γt表达量下降，使Th2细胞、Treg细胞相关抑炎因子IL-4、IL-10及特异性转录因子GATA-3、Foxp3表达量上升。同时，IHC及WB结果表明，IOP(100，200，300 mg/kg)对CD4+T细胞分化相关的上游通路JAK-STAT信号通路具有调控作用，使STAT1及STAT3的磷酸化水平下调，入核量减少，STAT6的磷酸化水平上调，入核量增多。流式细胞术结果表明，IOP(100，200，300 mg/kg)可以显著抑制脾脏及MLN中Th1细胞及Th17细胞的分化，促进Th2细胞及Treg细胞的分化，使结肠炎小鼠体内Th1/Th2细胞、Th17/Treg细胞轴趋向平衡。
研究结论:
1.我们所提取的IOP(100，200，300 mg/kg)可以显著缓解DSS诱导的慢性结肠炎的炎症情况。
2.IOP(100，200，300 mg/kg)对实验性结肠炎的治疗作用与调控Th1/Th2细胞、Th17/Treg细胞的分化平衡有关。
3.IOP(100，200，300 mg/kg)CD4+T细胞亚群的分化的作用可能与STAT1、STAT3、STAT6等蛋白的调控有关。
第二部分IOP对CD4+T细胞体外分化的影响
研究方法:
为探索IOP对Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞及Treg细胞分化过程的影响，CD4+免疫磁珠阴性分选法获取C57BL/6雄性小鼠脾脏CD4+T细胞，活细胞荧光染料CFSE(2μM)进行标记后，将细胞平均分为CD4+T组、对照组、IOP(10，20，40 mg/mL)三种剂量组(即IOP-L、IOP-M、IOP-H)，除CD4+T组外，均给予抗鼠CD3ε抗体(5μg/mL)及抗鼠CD28抗体(3μg/mL)刺激活化三天。流式细胞术检测IOP(L，M，H)分别对CD4+T细胞活化标志CD69、CD25的影响，以及对CD4+T细胞增殖率及增殖指数的影响。RT-PCR法检测Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞及Treg细胞相关细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10及特异性转录因子T-bet、GATA-3、ROR-γt、Foxp3基因水平的表达情况。酶联反应吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10蛋白水平的分泌情况。对Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞三种细胞亚群给予定向分化，同时给予IOP(L，M，H)处理，流式细胞术检测IOP(L，M，H)对Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞分化率的影响。
研究结果:
结果显示，与对照组相比，IOP(L，M，H)并不影响CD4+T细胞前期及后期的活化指标CD69、CD25的表达量，细胞的增殖率及增殖指数也未产生显著差异，提示IOP(L，M，H)可能并不作用于CD4+T细胞活化及增殖过程。RT-PCR结果显示，IOP(L，M，H)使活化的CD4+T细胞中，Th1细胞及Th17细胞相关的促炎因子IFN-γ、IL-17及特异性转录因子T-bet、ROR-γt的表达量明显降低，Treg相关的抑炎因子IL-10及特异性转录因子Foxp3的表达量明显上调，而对Th2细胞相关细胞因子IL-4及转录因子GATA-3作用较为局限。ELISA结果显示，IFN-γ、IL-17表达量下调，IL-10表达量上调。Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞定向分化实验结果显示，IOP(L，M，H)使Th1细胞、Th17细胞分化率显著下调，使Treg细胞的分化率显著上调，IOP(L，M，H)对CD4+T细胞分化阶段具有直接调控作用。
研究结论:
1.IOP(L，M，H)并不参与CD4+T细胞的活化及增殖阶段，而是对其分化阶段产生直接调控作用。
2.在体外，IOP(L，M，H)可以抑制Th1细胞、Th17细胞的分化，促进Treg细胞的分化，但是对Th2细胞的分化具有局限性。
第三部分IOP对BMDC成熟度及功能的影响
研究方法:
DC是刺激CD4+T细胞分化的最重要的APC，其表面MHC-Ⅱ、共刺激分子的表达以及分泌细胞因子类型对CD4+T细胞的分化方向起绝对作用，DC成熟度的不同是决定其介导免疫耐受或免疫应答的关键，因此，我们在体外实验中探讨IOP对BMDC成熟度的影响，以及对BMDC诱导免疫耐受能力的影响。取C57BL/6雄性6-8周龄小鼠大腿骨骨髓细胞，以2×106个/孔铺于六孔板，并给予rmGM-CSF(20 ng/mL)、rmIL-4(20 ng/mL)刺激分化6天，第7天收集板中悬浮及半悬浮细胞即为BMDC。采用100ng/mL脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)刺激BMDC24小时，使BMDC活化并成熟，即为BMDCLPS细胞，部分BMDCLPS细胞分别给予IOP(10，20，40 mg/mL)即IOPL,M,H处理。流式细胞术检测BMDC成熟度相关指标MHC-Ⅱ、CD40、CD86的表达情况，ELISA检测以及与诱导Th1细胞、Th17细胞和Treg细胞分化相关的细胞因子IL-12、IL-6、TGF-β的分泌情况。取不同处理的BMDC与CD4+T细胞以1∶5的比例共同培养，总细胞量2×106个/孔铺于六孔板中，建立混合淋巴反应(Mixed lymphocyte reaction，MLR)体系，流式细胞术检测Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞分化率，ELISA检测MLR体系中与此三种细胞分化启动相关的细胞因子IL-12、IL-6、TGF-β的分泌情况。
研究结果:
MHC-Ⅱ及表面共刺激分子CD40、CD86等的表达量是判断DC成熟与否的标志，同时也是激活CD4+T细胞的第一、二信号，流式细胞术结果显示，与未进行活化刺激的BMDC相比，BMDCLPS表面高表达MHC-Ⅱ以及共刺激分子CD40、CD86，成熟度显著升高。ELISA及流式细胞术检测显示，BMDCLPS分泌与Th1细胞、Th17细胞分化相关的细胞因子IL-12、IL-6明显增高，并使CD4+T细胞向Th1细胞、Th17细胞方向分化率显著上调，MLR体系整体呈现免疫激活状态。而IOPL.M,H-BMDCLPS组与BMDCLPS相比，MHC-Ⅱ、CD40及CD86的表达量均明显下降，成熟度显著降低，且TGF-β的分泌量明显提升，使CD4+T细胞向Treg细胞方向分化比率显著上调，使MLR体系呈现免疫耐受状态。
研究结论:
1.IOPL,M,H使BMDCLPS维持低成熟状态。
2.IOPL,M,H-BMDCLPS使CD4+T细胞向Treg细胞方向分化，具有维持免疫耐受的功能。
第四部分IOPL-BMDC对DSS诱导的急性结肠炎的治疗作用
研究方法:
各种功能稳定的免疫耐受性DC被应用到结肠炎模型的治疗中，并验证具有显著的治疗效果，耐受性DC是IBD细胞治疗的重要细胞来源，因此我们探索IOP诱导的耐受性BMDC是否可以通过调控CD4+T细胞的分化，诱导机体免疫耐受，从而达到治疗结肠炎的作用。C57BL/6雄性6-8周龄小鼠采用3％DSS6天造模法建立急性小鼠结肠炎模型，分为对照(Control)组、模型(DSS)组、BMDC组及IOPL-BMDC组，其中BMDC组及IOPL-BMDC组在给予3％DSS饮用水的前3天及第3天分别给予2×106个/只BMDC或IOPL-BMDC腹腔注射，并每日检测各组小鼠生存率、体重、是否便血及腹泻情况，并进行DAI评分。第7天断颈处死小鼠，测量小鼠结肠长度并拍照，评估小鼠肠道受损情况。结肠组织石蜡切片进行HE染色观察结肠组织完整性相关指标并进行组织学评分。IHC法检测小鼠结肠组织TJ蛋白ZO-1和Occludin的表达量，观察小鼠结肠组织完整性及黏膜损伤情况。取小鼠脾脏及MLN，流式细胞术检测Th1细胞、Th17细胞及Treg细胞的分化情况。ELISA法检测小鼠结肠组织匀浆上清液中与CD4+T细胞分化相关的细胞因子IL-12、IL-6、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-10的分泌情况。
研究结果:
BMDC及IOPL-BMDC的体内回输，使结肠炎小鼠体重变化率及DAI评分明显降低，恢复因炎症造成的结肠短缩，生存率得到明显改善，小鼠炎症程度得到显著控制。HE及IHC结果显示，与模型组相比，BMDC及IOPL-BMDC组小鼠结肠组织杯状数量增多，隐窝完整，组织完整性得到改善，TJ蛋白ZO-1、Occludin的流失减少，黏膜损伤程度明显降低，且以IOPL-BMDC抗炎效果更为显著。ELISA结果显示，IOPL-BMDC显著抑制与Th1细胞及Th17细胞分化相关的促炎因子IL-12、IFN-γ、IL-6、IL-17的分泌，提高Treg分化相关的抗炎因子TGF-β、IL-10的分泌。流式细胞术结果显示，Th17细胞亚群在正常组小鼠及结肠炎小鼠脾脏及MLN中的分化均不明显，模型组高表达促炎性T细胞亚群Th1细胞，低表达抗炎性T细胞亚群Treg细胞，给予BMDC及IOPL-BMDC回输治疗后，结肠炎小鼠脾脏及MLN中Th1细胞亚群分化率明显降低，而Treg细胞亚群分化率显著提升，其中以IOPL-BMDC组对CD4+T细胞亚群调控能力最为显著。
研究结论:
1.IOPL-BMDC可以通过调控结肠炎小鼠CD4+T细胞的分化缓解DSS诱导的小鼠急性炎症性肠病。
2.IOPL-BMDC为炎症性肠病的细胞治疗提供新的可能性，为耐受性DC的制备提供新的思路。
结论:
不同剂量IOP(100，200，300 mg/kg)均可显著改善DSS诱导的慢性结肠炎小鼠疾病进程，调控结肠炎小鼠脾脏、MLN及结肠组织中Th1/Th2、Th17/Treg细胞亚群平衡，这种调控作用可能与JAK-STAT信号通路有关。不同浓度IOP(10，20，40 mg/mL)均不影响体外的脾脏来源的CD4+T细胞增殖及活化，对分化具有直接调控作用，抑制Th1细胞、Th17细胞分化，促进Treg细胞分化，对Th2细胞的分化调控具有局限性。IOPL,M,H均可维持LPS(100 ng/mL)诱导的炎性环境下BMDC的低成熟状态，并促进MLR反应体系中CD4+T细胞向Treg细胞方向分化，抑制Th1细胞及Th17细胞的分化。IOPL-BMDC显著缓解DSS诱导的急性炎症性肠病，并调控结肠炎小鼠脾脏及MLN中CD4+T细胞亚群分化，抑制Th1细胞分化，促进Treg细胞分化，对Th17细胞分化具有一定局限性。
炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一种非特异性炎症性肠道疾病，主要包括克罗恩病(Crohns disease，CD)和溃疡性炎症性肠病(Ulcerative colitis，UC)两种疾病形式，此病在欧美国家多发，截至2015年，美国IBD患者数量已超过100万，欧洲超过250万，欧美等发达国家IBD发病率高达0.5％。近十年发现，亚洲、中东及南美等地区的新兴工业化国家IBD发病率也持续增加。由于新兴工业化国家发病率及人口总量急剧增长，预测至2025年，IBD患者总量将与西方国家人口总量相持平，IBD将成为新的全球性负担。IBD多发病于青壮年时期，致病因素尚不明确，多认为与易感基因突变、环境的改变、肠道菌群失衡及免疫应答异常等有关，致病因素的不确定性及多样性加剧了IBD的治疗难度，其中免疫功能紊乱及免疫应答异常，被认为是引起IBD发病的主要因素，也是靶向治疗IBD的主要目标。
树突状细胞(Dendritic cells，DC)是功能最强大的专职抗原提呈细胞(Antigen presenting cell，APC)，是连接固有免疫和适应性免疫的“桥梁”，通过自身耐受性及分泌的特异性细胞因子的不同，调控CD4+T细胞分化为不同的辅助T细胞(T helper cells，Th)或调节性T细胞(Regulatory cells，Treg)，使免疫系统发挥免疫激活或免疫耐受作用，进而参与包括IBD在内的多种自身免疫性疾病的发生与发展。CD4+T细胞主要由Th细胞亚群和Treg细胞亚群组成，IBD患者结肠组织往往伴随大量CD4+T细胞的浸润，最初认为Th1/Th2细胞分化失衡是介导IBD发病的主要机制，Th1细胞的过度活化使促炎因子IFN-γ大量表达，抑制IL-4依赖性的Th2细胞的分化，使Th1/Th2细胞轴产生严重偏移，加剧炎症反应，进而在IBD中发挥致病作用。随着IL-17分泌性Th17细胞亚群在IBD患者中检出，Th17细胞在IBD中的致病作用被逐步确定，补充了Th1/Th2细胞失衡致病的理论。Th17细胞通过分泌促炎因子IL-17参与炎症反应，介导剧烈的组织损伤，其分化呈IL-6依赖性。IL-6抑制TGF-β依赖性亚群Treg细胞的分化，Treg细胞数量不足或功能受损也是IBD发病的机制之一，因此Th17/Treg细胞的分化失衡，成为介导IBD的新型机制，并被广泛探究。
目前，IBD的治疗方案主要集中在药物治疗，主要包括氨基水杨酸类药物、皮质类固醇类药物、免疫抑制剂、单抗药物，及其他选择性药物如抗生素、益生菌、维生素及罗格列酮等。随着细胞分子医学及免疫学的深入研究，更多的IBD机制及药物靶点被发现，使IBD的治疗药物及治疗方式呈现多元化开发。然而目前IBD仍然难以被根治，复发率极高，且治疗药物价格昂贵、用药周期长、不良反应等因素，促使研究人员不断探索新的安全、高效、平价的IBD治疗药物或治疗手段。
研究目的:
桦褐孔菌又称白桦茸，是生长于白桦、银桦、榆树、赤杨等树皮下的一种可食用真菌，多分布于北纬40-50°的寒冷地带，如我国黑龙江省、吉林省长白山等地区，欧洲国家早在16世纪便利用其治疗恶性肿瘤、糖尿病、炎症等难治性疾病。桦褐孔菌多糖(Inonotus obliquus polysaccharide，IOP)是由桦褐孔菌提取的最具有药用价值的活性成分之一，具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节、降血糖、降血脂等多种生物活性，但其对葡聚糖硫酸钠(Dextran sulphate sodium，DSS)诱导的实验性结肠炎的治疗作用及相关机制尚不明确。因此本研究采用不同浓度的IOP探索其对DSS诱导的急、慢性结肠炎的治疗作用，并探索其与DC及CD4+T细胞相关的治疗机制，为IOP治疗IBD提供可行性及理论依据，并通过IOP诱导的耐受性骨髓来源树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cells，BMDC)的体内回输，为IBD免疫细胞治疗提供新的可能性。
第一部分IOP对DSS诱导的慢性炎症性肠病的治疗作用
研究方法:
采用热水浸提法提取IOP，并采用高效液相检测IOP的单糖组成。BALB/c雄性6-8周龄小鼠给予3％DSS三次循环共43天造模法建立慢性结肠炎模型，实验组给予三种不同浓度IOP(100，200，300 mg/kg)处理，每日检测小鼠体重、粪便性状、便血情况，并进行疾病活动指数(Disease active index，DAI)评分。第44天脱颈法处死小鼠，测量小鼠结肠长度，评估小鼠肠道炎症严重程度。小鼠结肠石蜡切片进行苏木素-伊红染色(Hematoxylin-Eosin staining，HE)染色并进行组织学评分，免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)法检测小鼠结肠组织中带状闭合蛋白(Zonula occludens-1 protein，ZO-1)、Occludin这两种紧密连接(Tight junction，TJ)蛋白的表达，观察小鼠结肠组织完整性及黏膜损伤情况;逆转录-聚合链酶反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)法检测小鼠结肠组织中与Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Treg细胞相关的特异性细胞因子及转录因子的基因水平表达情况。流式细胞术检测小鼠脾脏及肠系膜淋巴结(Mesenteric lymph node，MLN)中Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Treg细胞的分化情况。IHC及免疫印迹(Western blot，WB)法检测与CD4+T细胞分化相关的JAK-STAT信号通路相关蛋白STAT1、STAT3、STAT6在结肠组织中的表达情况。
研究结果:
经高效液相法检测，我们所提取的IOP主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖组成，含量分别为9.2％、4.4％、46.6％、11.5％、11.1％、4.3％。糖度仪检测多糖含量大于90％，适用于后续研究。与模型组相比，IOP(100，200，300 mg/kg)治疗组小鼠体重变化率较小，结肠长度明显恢复，DAI及组织学评分显著降低，肠道炎症情况得到明显改善，结肠组织TJ蛋白ZO-1及Occludin丢失较少，显著保护了结肠组织通透性及完整性。RT-PCR结果显示，IOP(100，200，300 mg/kg)使结肠组织中Th1细胞、Th17细胞相关促炎因子IFN-γ、IL-17及特异性转录因子T-bet、ROR-γt表达量下降，使Th2细胞、Treg细胞相关抑炎因子IL-4、IL-10及特异性转录因子GATA-3、Foxp3表达量上升。同时，IHC及WB结果表明，IOP(100，200，300 mg/kg)对CD4+T细胞分化相关的上游通路JAK-STAT信号通路具有调控作用，使STAT1及STAT3的磷酸化水平下调，入核量减少，STAT6的磷酸化水平上调，入核量增多。流式细胞术结果表明，IOP(100，200，300 mg/kg)可以显著抑制脾脏及MLN中Th1细胞及Th17细胞的分化，促进Th2细胞及Treg细胞的分化，使结肠炎小鼠体内Th1/Th2细胞、Th17/Treg细胞轴趋向平衡。
研究结论:
1.我们所提取的IOP(100，200，300 mg/kg)可以显著缓解DSS诱导的慢性结肠炎的炎症情况。
2.IOP(100，200，300 mg/kg)对实验性结肠炎的治疗作用与调控Th1/Th2细胞、Th17/Treg细胞的分化平衡有关。
3.IOP(100，200，300 mg/kg)CD4+T细胞亚群的分化的作用可能与STAT1、STAT3、STAT6等蛋白的调控有关。
第二部分IOP对CD4+T细胞体外分化的影响
研究方法:
为探索IOP对Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞及Treg细胞分化过程的影响，CD4+免疫磁珠阴性分选法获取C57BL/6雄性小鼠脾脏CD4+T细胞，活细胞荧光染料CFSE(2μM)进行标记后，将细胞平均分为CD4+T组、对照组、IOP(10，20，40 mg/mL)三种剂量组(即IOP-L、IOP-M、IOP-H)，除CD4+T组外，均给予抗鼠CD3ε抗体(5μg/mL)及抗鼠CD28抗体(3μg/mL)刺激活化三天。流式细胞术检测IOP(L，M，H)分别对CD4+T细胞活化标志CD69、CD25的影响，以及对CD4+T细胞增殖率及增殖指数的影响。RT-PCR法检测Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞及Treg细胞相关细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10及特异性转录因子T-bet、GATA-3、ROR-γt、Foxp3基因水平的表达情况。酶联反应吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10蛋白水平的分泌情况。对Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞三种细胞亚群给予定向分化，同时给予IOP(L，M，H)处理，流式细胞术检测IOP(L，M，H)对Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞分化率的影响。
研究结果:
结果显示，与对照组相比，IOP(L，M，H)并不影响CD4+T细胞前期及后期的活化指标CD69、CD25的表达量，细胞的增殖率及增殖指数也未产生显著差异，提示IOP(L，M，H)可能并不作用于CD4+T细胞活化及增殖过程。RT-PCR结果显示，IOP(L，M，H)使活化的CD4+T细胞中，Th1细胞及Th17细胞相关的促炎因子IFN-γ、IL-17及特异性转录因子T-bet、ROR-γt的表达量明显降低，Treg相关的抑炎因子IL-10及特异性转录因子Foxp3的表达量明显上调，而对Th2细胞相关细胞因子IL-4及转录因子GATA-3作用较为局限。ELISA结果显示，IFN-γ、IL-17表达量下调，IL-10表达量上调。Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞定向分化实验结果显示，IOP(L，M，H)使Th1细胞、Th17细胞分化率显著下调，使Treg细胞的分化率显著上调，IOP(L，M，H)对CD4+T细胞分化阶段具有直接调控作用。
研究结论:
1.IOP(L，M，H)并不参与CD4+T细胞的活化及增殖阶段，而是对其分化阶段产生直接调控作用。
2.在体外，IOP(L，M，H)可以抑制Th1细胞、Th17细胞的分化，促进Treg细胞的分化，但是对Th2细胞的分化具有局限性。
第三部分IOP对BMDC成熟度及功能的影响
研究方法:
DC是刺激CD4+T细胞分化的最重要的APC，其表面MHC-Ⅱ、共刺激分子的表达以及分泌细胞因子类型对CD4+T细胞的分化方向起绝对作用，DC成熟度的不同是决定其介导免疫耐受或免疫应答的关键，因此，我们在体外实验中探讨IOP对BMDC成熟度的影响，以及对BMDC诱导免疫耐受能力的影响。取C57BL/6雄性6-8周龄小鼠大腿骨骨髓细胞，以2×106个/孔铺于六孔板，并给予rmGM-CSF(20 ng/mL)、rmIL-4(20 ng/mL)刺激分化6天，第7天收集板中悬浮及半悬浮细胞即为BMDC。采用100ng/mL脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)刺激BMDC24小时，使BMDC活化并成熟，即为BMDCLPS细胞，部分BMDCLPS细胞分别给予IOP(10，20，40 mg/mL)即IOPL,M,H处理。流式细胞术检测BMDC成熟度相关指标MHC-Ⅱ、CD40、CD86的表达情况，ELISA检测以及与诱导Th1细胞、Th17细胞和Treg细胞分化相关的细胞因子IL-12、IL-6、TGF-β的分泌情况。取不同处理的BMDC与CD4+T细胞以1∶5的比例共同培养，总细胞量2×106个/孔铺于六孔板中，建立混合淋巴反应(Mixed lymphocyte reaction，MLR)体系，流式细胞术检测Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞分化率，ELISA检测MLR体系中与此三种细胞分化启动相关的细胞因子IL-12、IL-6、TGF-β的分泌情况。
研究结果:
MHC-Ⅱ及表面共刺激分子CD40、CD86等的表达量是判断DC成熟与否的标志，同时也是激活CD4+T细胞的第一、二信号，流式细胞术结果显示，与未进行活化刺激的BMDC相比，BMDCLPS表面高表达MHC-Ⅱ以及共刺激分子CD40、CD86，成熟度显著升高。ELISA及流式细胞术检测显示，BMDCLPS分泌与Th1细胞、Th17细胞分化相关的细胞因子IL-12、IL-6明显增高，并使CD4+T细胞向Th1细胞、Th17细胞方向分化率显著上调，MLR体系整体呈现免疫激活状态。而IOPL.M,H-BMDCLPS组与BMDCLPS相比，MHC-Ⅱ、CD40及CD86的表达量均明显下降，成熟度显著降低，且TGF-β的分泌量明显提升，使CD4+T细胞向Treg细胞方向分化比率显著上调，使MLR体系呈现免疫耐受状态。
研究结论:
1.IOPL,M,H使BMDCLPS维持低成熟状态。
2.IOPL,M,H-BMDCLPS使CD4+T细胞向Treg细胞方向分化，具有维持免疫耐受的功能。
第四部分IOPL-BMDC对DSS诱导的急性结肠炎的治疗作用
研究方法:
各种功能稳定的免疫耐受性DC被应用到结肠炎模型的治疗中，并验证具有显著的治疗效果，耐受性DC是IBD细胞治疗的重要细胞来源，因此我们探索IOP诱导的耐受性BMDC是否可以通过调控CD4+T细胞的分化，诱导机体免疫耐受，从而达到治疗结肠炎的作用。C57BL/6雄性6-8周龄小鼠采用3％DSS6天造模法建立急性小鼠结肠炎模型，分为对照(Control)组、模型(DSS)组、BMDC组及IOPL-BMDC组，其中BMDC组及IOPL-BMDC组在给予3％DSS饮用水的前3天及第3天分别给予2×106个/只BMDC或IOPL-BMDC腹腔注射，并每日检测各组小鼠生存率、体重、是否便血及腹泻情况，并进行DAI评分。第7天断颈处死小鼠，测量小鼠结肠长度并拍照，评估小鼠肠道受损情况。结肠组织石蜡切片进行HE染色观察结肠组织完整性相关指标并进行组织学评分。IHC法检测小鼠结肠组织TJ蛋白ZO-1和Occludin的表达量，观察小鼠结肠组织完整性及黏膜损伤情况。取小鼠脾脏及MLN，流式细胞术检测Th1细胞、Th17细胞及Treg细胞的分化情况。ELISA法检测小鼠结肠组织匀浆上清液中与CD4+T细胞分化相关的细胞因子IL-12、IL-6、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-10的分泌情况。
研究结果:
BMDC及IOPL-BMDC的体内回输，使结肠炎小鼠体重变化率及DAI评分明显降低，恢复因炎症造成的结肠短缩，生存率得到明显改善，小鼠炎症程度得到显著控制。HE及IHC结果显示，与模型组相比，BMDC及IOPL-BMDC组小鼠结肠组织杯状数量增多，隐窝完整，组织完整性得到改善，TJ蛋白ZO-1、Occludin的流失减少，黏膜损伤程度明显降低，且以IOPL-BMDC抗炎效果更为显著。ELISA结果显示，IOPL-BMDC显著抑制与Th1细胞及Th17细胞分化相关的促炎因子IL-12、IFN-γ、IL-6、IL-17的分泌，提高Treg分化相关的抗炎因子TGF-β、IL-10的分泌。流式细胞术结果显示，Th17细胞亚群在正常组小鼠及结肠炎小鼠脾脏及MLN中的分化均不明显，模型组高表达促炎性T细胞亚群Th1细胞，低表达抗炎性T细胞亚群Treg细胞，给予BMDC及IOPL-BMDC回输治疗后，结肠炎小鼠脾脏及MLN中Th1细胞亚群分化率明显降低，而Treg细胞亚群分化率显著提升，其中以IOPL-BMDC组对CD4+T细胞亚群调控能力最为显著。
研究结论:
1.IOPL-BMDC可以通过调控结肠炎小鼠CD4+T细胞的分化缓解DSS诱导的小鼠急性炎症性肠病。
2.IOPL-BMDC为炎症性肠病的细胞治疗提供新的可能性，为耐受性DC的制备提供新的思路。
结论:
不同剂量IOP(100，200，300 mg/kg)均可显著改善DSS诱导的慢性结肠炎小鼠疾病进程，调控结肠炎小鼠脾脏、MLN及结肠组织中Th1/Th2、Th17/Treg细胞亚群平衡，这种调控作用可能与JAK-STAT信号通路有关。不同浓度IOP(10，20，40 mg/mL)均不影响体外的脾脏来源的CD4+T细胞增殖及活化，对分化具有直接调控作用，抑制Th1细胞、Th17细胞分化，促进Treg细胞分化，对Th2细胞的分化调控具有局限性。IOPL,M,H均可维持LPS(100 ng/mL)诱导的炎性环境下BMDC的低成熟状态，并促进MLR反应体系中CD4+T细胞向Treg细胞方向分化，抑制Th1细胞及Th17细胞的分化。IOPL-BMDC显著缓解DSS诱导的急性炎症性肠病，并调控结肠炎小鼠脾脏及MLN中CD4+T细胞亚群分化，抑制Th1细胞分化，促进Treg细胞分化，对Th17细胞分化具有一定局限性。