动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）严重危害人类的健康，免疫调控失衡在AS的发病机制中占有重要地位。罗仙子原名蛆，又称五谷虫，为我国传统药材之一，收录于《本草纲目》虫部第四十卷，具有清热解毒、消滞化积及提高机体免疫力等功效。近年来，罗仙子在食品、保健品及药品等方面的开发和利用引起社会的广泛关注。本课题组在前期研究中发现，罗仙子富含蛋白的提取物能够有效改善AS小鼠动脉血管的粥样化病变，显著降低动物血清中相关炎症因子水平；经葡聚糖凝胶色谱分离、体外抗炎活性筛选、冷冻干燥等获得分子量在30KD以下的活性部位，其在AS小鼠体内具有更好的抗AS功效，且发现其对免疫系统具有一定的调节作用。如前所述，免疫反应是影响AS进程的关键因素，而淋巴细胞是免疫系统的主要细胞群体，淋巴细胞及其亚群在免疫反应中相互协作、互相制约，从而维持机体免疫系统的稳态。基于此，本文通过研究罗仙子有效部位在AS小鼠的体内功效以及对淋巴细胞的体外作用，从免疫调控的角度，初步探讨罗仙子有效部位抗AS的作用与机制。研究目的：通过观察罗仙子有效部位（Oriental Latrine Fly Larvina-Effective Fraction,OLFL-EF）抗小鼠AS的体内功效，检测其对动物血脂、炎症因子及相关免疫分子表达的影响，结合胸主动脉及脾脏组织形态学以及淋巴细胞亚群CD4+/CD8+T细胞比例的变化情况，明确OLFL-EF在AS小鼠体内的治疗作用以及对淋巴细胞分化的影响；以脾淋巴细胞及分离的T、B细胞为实验对象，通过体外实验观察OLFL-EF对上述细胞增殖、分化及分泌功能的影响，初步明确在抗AS过程中，OLFL-EF调节淋巴细胞功能的作用及机制。结合动物整体水平、细胞水平及分子水平实验结果，从免疫调控的角度，初步阐明OLFL-EF抗AS的作用与机制。研究方法：1、OLFL-EF抗小鼠AS的体内功效(1) AS小鼠模型构建：采用高胆固醇溶液灌胃联合LPS肌肉注射的方法建立AS小鼠模型，以灌胃方式给予OLFL-EF（200mg/kg/d）进行实验干预。实验设置正常对照组、阴性对照组、辛伐他汀组（25mg/kg/d）和OLFL-EF组，给药6周后，观察治疗效果。(2) OLFL-EF对AS小鼠血脂的调节作用：取血清，采用胆固醇氧化酶法检测总胆固醇（TC）水平，磷酸甘油氧化酶法测定甘油三酯（TG）水平，聚乙烯硫酸选择性沉淀法检测低密度脂蛋白（LDL）水平以及磷钨酸-镁沉淀法检测高密度脂蛋白（HDL）水平。(3) OLFL-EF对AS小鼠血清中炎症因子及相关免疫分子的影响：采用ELISA法检测炎症因子TNFα及IL-6水平，以及免疫分子IL-10及TGF-β1水平。(4) OLFL-EF对AS小鼠胸主动脉及脾脏组织形态学的影响：①取小鼠胸主动脉，HE染色观察胸主动脉的AS病理变化情况，并统计胸主动脉的内膜面积、中膜面积以及两者的比例。②取小鼠脾脏，HE染色观察脾脏的组织形态学改变。③采用免疫荧光方法检测脾脏中CD4+和CD8+T细胞的比例。2、OLFL-EF对淋巴细胞的体外作用(1) OLFL-EF对脾淋巴细胞的影响：①原代培养小鼠脾淋巴细胞，并在不同浓度的OLFL-EF的作用下，观察由刀豆蛋白A（ConA）及脂多糖（LPS）分别诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响，明确OLFL-EF的安全实验浓度。②OLFL-EF对ConA诱导的脾淋巴细胞的影响：设正常对照组、ConA组和ConA/OLFL-EF组，采用MTT法观察在不同时间点OLFL-EF对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响，流式细胞术检测细胞周期分布，并采用流式细胞术检测T细胞亚群CD4+和CD8+T细胞以及调节性T（Treg）细胞比例的变化。③OLFL-EF对LPS诱导的脾淋巴细胞的影响：设正常对照组、LPS组和LPS/OLFL-EF组，采用MTT法观察在不同时间点OLFL-EF对LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响，流式细胞术检测细胞周期分布。(2) OLFL-EF对T细胞的影响：采用尼龙毛柱法分离T、B细胞，设正常对照组、ConA组和ConA/OLFL-EF组，采用MTT法检测OLFL-EF在不同时间点对T细胞增殖的影响；ELISA法检测培养液上清中炎性因子TNFα及IL-6水平，以及免疫分子IL-10和TGF-β1水平。(3) OLFL-EF对B细胞的影响：采用尼龙毛柱法分离T、B细胞，设正常对照组、LPS组和LPS/OLFL-EF组，MTT法观察OLFL-EF在不同时间点对B细胞增殖的影响。研究结果：1、OLFL-EF抗小鼠AS的体内功效(1) AS小鼠模型建立：高胆固醇溶液灌胃联合LPS肌肉注射的方法可成功建立AS小鼠模型，模型组小鼠的胸主动脉出现典型的AS病变：内膜增厚，内皮细胞厚薄不均，内皮细胞坏死脱落，中膜的平滑肌细胞排列紊乱，内膜及中膜间隙明显增大，可见泡沫细胞浸润。胸主动脉的内膜面积、中膜面积显著增大（P＜0.01），两者的比例也显著升高（P＜0.01）。血清中TC、TG及LDL水平显著升高（P＜0.01），HDL水平显著降低（P＜0.01），炎症因子TNFα及IL-6水平显著升高（P＜0.01），免疫分子IL-10及TGF-β1水平显著降低（P＜0.01）。(2) OLFL-EF对AS小鼠血脂的调节作用：OLFL-EF处理6周后，血清中TC（阴性对照组vs. OLFL-EF组：6.39±0.14vs.4.53±0.05）、TG（阴性对照组vs. OLFL-EF组：3.42±0.04vs.2.24±0.12）、LDL（阴性对照组vs. OLFL-EF组：3.37±0.07vs.1.91±0.08）水平显著降低（P＜0.01），HDL（阴性对照组vs. OLFL-EF组：0.83±0.15vs.1.05±0.07）水平升高（P＜0.01）。(3) OLFL-EF对AS小鼠血清中炎症因子及相关免疫分子的影响：OLFL-EF处理6周后，血清中炎症因子TNFα（阴性对照组vs. OLFL-EF组：1.74±0.03vs.1.24±0.14）及IL-6（阴性对照组vs. OLFL-EF组：74.36±0.53vs.41.62±0.03）的水平显著降低（P＜0.01），免疫分子IL-10(阴性对照组vs. OLFL-EF组：25.23±0.31vs.59.89±0.21)和TGF-β1（阴性对照组vs. OLFL-EF组：82.27±0.11vs.187.14±0.18）的水平显著升高（P＜0.01）。(4) OLFL-EF对AS小鼠胸主动脉及脾脏的组织形态学的影响：①小鼠胸主动脉病理变化：OLFL-EF处理小鼠6周后，小鼠胸主动脉血管厚度明显变薄，中膜与内膜轮廓边缘清晰可见，泡沫细胞堆积减少，AS病变得到明显改善。胸主动脉的内膜面积（阴性对照组vs. OLFL-EF组：8551.9±188.45vs.1874.2±132.32）、中膜面积（阴性对照组vs. OLFL-EF组：17215±243.52vs.14385±241.19）显著增大（P＜0.01），两者的比例（阴性对照组vs. OLFL-EF组：0.497±0.134vs.0.130±0.027）也显著升高（P＜0.01）。②脾脏组织形态学变化：OLFL-EF处理小鼠后，小鼠的脾小体边缘较清晰，可见生发中心有B细胞产生，动脉周围淋巴鞘边缘较小，T细胞数量减少。③脾脏中CD4+和CD8+T细胞的比例变化：OLFL-EF处理小鼠后，T细胞的聚集减少，CD4+和CD8+T细胞比例降低。2、OLFL-EF在体外对淋巴细胞增殖、分化及分泌功能的影响(1) OLFL-EF对脾淋巴细胞的影响①原代培养小鼠脾淋巴细胞的结果：小鼠脾淋巴细胞为悬浮生长，圆形，折光度好，均匀分散于培养介质中。②确定安全有效实验浓度：不同浓度的OLFL-EF作用于ConA及LPS分别诱导的小鼠脾淋巴细胞的实验结果显示，OLFL-EF在浓度为5-100μg/mL的范围内，均能显著促进脾淋巴细胞增殖（P＜0.01），在浓度范围5-40μg/mL呈一定剂量的依赖性，在浓度为40μg/mL时，其促进细胞增殖的作用最为明显，高于40μg/mL时，促增殖作用下降（可能是细胞毒性），故本实验选取40μg/mL为最佳安全有效实验浓度。③OLFL-EF对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞的作用OLFL-EF在12h-72h的时间范围内，均能显著促进ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖（P＜0.01），且在12h-48h的范围内，呈一定的时间依赖性。在培养48h（ConA组vs. ConA/OLFL-EF组：0.407±0.003vs.0.698±0.004）后，其增殖促进率（ConA组vs. ConA/OLFL-EF组：91.67±0.29vs.180.11±0.47）升高最为显著。流式细胞术检测细胞周期分布的结果显示：OLFL-EF能显著降低ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞中G0/G1期细胞的百分比（P＜0.01），升高S期和G2/M期细胞的百分比（P＜0.01），在OLFL-EF处理48h后，其S期分数（S-Phase fraction, SPF）（12.23±0.2%）及增殖指数（Proliferation index，PI）（21.50±0.96%）最大，表明在48h时，OLFL-EF促进ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞从G0/G1期进入S期和G2/M期的作用最明显。流式细胞术检测T细胞亚群CD4+和CD8+T细胞比例的结果显示：OLFL-EF处理细胞24h、48h和72h后，CD4+T细胞比例显著降低（P＜0.01），CD4+/CD8+比值在24h（ConA组vs. ConA/OLFL-EF组：1.60±0.35vs.1.34±0.89）、48h（ConA组vs.ConA/OLFL-EF组：1.64±0.21VS1.26±0.28）、72h（ConA组vs. ConA/OLFL-EF组：1.63±0.43vs.1.24±0.31）均显著降低（P＜0.01），分别下降了0.26、0.38和0.39。流式细胞术检测Treg细胞比例的结果显示：OLFL-EF处理细胞24h（ConA组vs. ConA/OLFL-EF组：6.21±0.13vs.7.49±0.22）、48h（ConA组vs. ConA/OLFL-EF组：6.96±0.32vs.10.22±0.78）后，Treg细胞比例显著升高（P＜0.01）。④OLFL-EF对LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞的作用OLFL-EF在不同时间点对LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞的作用结果显示：OLFL-EF在12h-72h的范围内，均能显著促进LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖（P＜0.01），在12h-48h的范围内，呈一定的时间依赖性。培养48h（LPS组vs. LPS/OLFL-EF组：0.356±0.003vs.0.565±0.002）后，其增殖促进率（LPS组vs. LPS/OLFL-EF组：71.37±0.93vs.102.15±0.32）最大，OLFL-EF促进LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖效果最明显。流式细胞术检测细胞周期分布的结果显示：OLFL-EF能显著降低LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞中G0/G1期细胞的百分比（P＜0.01），升高S期和G2/M期细胞的百分比（P＜0.01），在OLFL-EF处理72h后，其SPF值（6.03±0.59%）及PI值（13.24±0.45%）最大，表明在72h时，OLFL-EF促进细胞从G0/G1期进入S期和G2/M期的作用最明显。(2) OLFL-EF对T细胞的影响尼龙毛柱法将T、B细胞分离后，T细胞经OLFL-EF处理24h（ConA组vs.ConA/OLFL-EF组：0.305±0.003vs.0.265±0.015）和48h（ConA组vs. ConA/OLFL-EF组：0.315±0.032vs.0.242±0.008）后，能显著抑制T细胞增殖（P＜0.01），其增殖率在48h（ConA组vs. ConA/OLFL-EF组：5.15±0.13vs.-7.41±0.06）时最小，表明在48h时，OLFL-EF能显著抑制T细胞增殖（P＜0.01）。培养液上清中炎症因子TNFα（正常对照组vs. OLFL-EF组：1.22±0.13vs.1.14±0.145）及IL-6（正常对照组vs. OLFL-EF组：40.58±0.26vs.33.42±0.13）水平显著降低（P＜0.01），免疫分子IL-10（正常对照组vs. OLFL-EF组：63.17±0.45vs.72.47±0.18）和TGF-β1（正常对照组vs. OLFL-EF组：190.31±0.23vs.199.14±0.48）水平显著升高（P＜0.01）。(3) OLFL-EF对B细胞的影响OLFL-EF处理B细胞24h（LPS组vs. LPS/OLFL-EF组：0.323±0.004vs.0.345±0.021）和48h（LPS组vs. LPS/OLFL-EF组：0.346±0.017vs.363±0.013）后，能显著促进B细胞增殖（P＜0.01），其增殖率在48h（LPS组vs. LPS/OLFL-EF组：27.48±0.13vs.33.62±0.09）时最大，OLFL-EF能显著促进B细胞增殖（P＜0.01）。结论：OLFL-EF在AS小鼠体内能够显著改善动脉血管粥样病变，对AS有显著的治疗作用，其在体外能够对淋巴细胞的增殖、分化及分泌功能进行有效的调节，从而维持机体的免疫稳态，这可能是其发挥抗AS作用的机制之一。