SWS1介导的紫光/紫外光对斑马鱼皮肤黑色素细胞形成的影响

来源 :上海海洋大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:yingxiong324
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不同水环境中的鱼类体色存在较大的差别,决定鱼类体色的主要成因是皮肤上的色素细胞吸收射入水体中的特定波长的光线,同时反射其他波长的光线。最终的体色形态则由色素细胞的数目、所处位置和细胞内色素颗粒的形态等共同呈现。随着生境的变化,在不同的生长发育阶段,鱼类的体色都会随之变化,主要体现在形态学和生理学这两方面。形态学层面的体色变化主要包括色素细胞的位置移动、细胞及颗粒数量的改变。生理学层面的体色变化主要包括色素颗粒的聚散运动、神经激素的反馈调节等。在鱼类的生长发育过程中,当光线透过水面作用于皮肤上时,为了适应光照鱼类会形成一种自身保护机制——隐蔽伪装色(countershading),即背部体色深,腹部体色浅的现象。隐蔽伪装色的形成可以帮助鱼类躲避敌害、提高自身捕食的成功率。研究表示紫外线作为外源刺激性的促细胞分裂剂是皮肤色素沉着的主要刺激因素,能显著促进隐蔽伪装色的形成,但目前尚不清楚其具体作用机制。本学位论文在前人研究的基础上,进一步验证紫光/紫外光对模式生物斑马鱼隐蔽伪装色形成的作用。首先,利用CRISPR/Cas9技术在斑马鱼中进行感紫光视蛋白SWS1基因的敲除,经过杂交传代后得到纯合敲除体的斑马鱼品系。接着设置3个对照组和3个实验组,调节紫光灯的光强在2000±100LUX范围内,从背部分别照射野生型AB品系斑马鱼和纯合突变体SWS1-/-品系斑马鱼,照射总时长为100天。紫光/紫外光照射60天和100天时,每组取30尾斑马鱼,对其背腹部皮肤的黑色素细胞进行计数和分析,分析发现紫光/紫外光能通过SWS1基因促进斑马鱼背部皮肤黑色素细胞的形成。之后,从每组中各取3尾斑马鱼,提取背部皮肤的RNA,利用Illumina转录组技术进行测序分析,得到两组的差异显著基因以及行使的功能类别,并通过组间比较富集得到与色素细胞形成相关的KEGG通路。两组间显示差异显著基因总数为856个,其中下调基因数为375个,上调基因数为481个。GO功能富集分析显示,2组差异表达基因的富集类型主要集中在蛋白质水解、氧化还原过程等生物学进程。富集到的10条与色素细胞相关的KEGG通路,包括PPAR signaling pathway、Pyrimidine metabolism、Cell adhesion molecules(CAMs)、Linoleic acid metabolism、Peroxisome、Retinol metabolism、Vitamin digestion and absorption、Phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesi、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450、Metabolic pathways。在上述通路中,总共汇集了120个显著差异表达基因,其中20个表达上调,100个表达下调,说明SWS1基因的缺失会影响视黄醇代谢、维生素消化吸收、信号分子的相互作用、细胞代谢途径等生理进程。在众多表达下调的基因中,我们发现了属于细胞色素P450酶系的成员,如CYP1a(P450第1家族A亚族)、CYP2p9(P450第2家族P亚族第9个基因)、CYP3A65(P450第3家族A亚族第65个基因)等,以及RDH12(视黄醇脱氢酶12)。研究表明,它们参与视黄醇及视黄醛的氧化代谢通路。最后,利用荧光实时定量PCR技术(Q-RT PCR)对黑色素细胞形成相关的基因如前阿黑皮素(POMC)、视黄醛脱氢酶(RALDH)也称乙醛脱氢酶(ALDH)RALDH2、RALDH3以及Agouti信号蛋白家族成员ASIP1等基因分别在斑马鱼背部和腹部皮肤上的表达量进行比较分析。以β-actin为内参,结果分析发现紫光/紫外光照射100天后,野生型斑马鱼RALDH2的表达量背部高于腹部且差异显著,而纯合品系腹部表达量高于背部且差异极显著;野生型斑马鱼POMC的表达量背部高于腹部且差异极显著,而纯合品系背腹部未有显著差异,而且与野生型的斑马鱼相比,纯合品系斑马鱼背部皮肤中POMC和RALDH2的表达量要显著下降,但在腹部的表达上两者均未有显著性,表明破坏SWS1功能会导致原本背腹部皮肤RALDH2、POMC基因差异表达水平的破坏。此外,在本研究中,发现SWS1敲除并不影响RALDH3和ASIP1的背腹表达差异。综上所述,紫光/紫外光能够通过SWS1基因促进斑马鱼背部皮肤黑色素细胞的形成。当SWS1基因纯合敲除后与视黄酸合成、表达相关的基因,如细胞色素P450家系部分成员、视黄醇脱氢酶12(RDH12)等都出现了表达下降的情况。同时,紫光/紫外光能够通过SWS1基因显著影响斑马鱼皮肤RALDH2基因的表达进而影响POMC基因,从而调控黑色素细胞的形成。
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