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目的与意义:随着对基质金属蛋白酶(MMPs)认识的深入,MMPs在肿瘤生长、侵袭、转移中的作用越来越引起人们的重视。目前,应用MMPs抑制剂治疗肿瘤已成为肿瘤研究的新方向。多西环素(DOX,一种半合成四环素族抗生素)是MMPs抑制剂的一种,因其毒性小、半衰期长而研究较为广泛。本课题通过研究DOX对肺癌A549细胞生长、侵袭、转移特性的影响及相关机制的研究,为肺癌的治疗提供一个新的方法与手段。方法:应用MTT比色法观察DOX对A549细胞体外增殖的影响;应用透射电镜、荧光显微镜、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪研究DOX对A549细胞的促凋亡作用;通过细胞体外粘附试验、划痕试验、侵袭试验、裸鼠人工肺转移模型等的方法研究DOX对A549细胞的粘附、侵袭和移动力可能存在的作用;通过明胶底物SDS-PAGE凝胶电泳、RT-PCR、Western Blot观察DOX对明胶酶活性、表达的影响;应用免疫组化的方法观察DOX对A549细胞VEGF表达的影响。并应用RT-PCR、Western Blot观察DOX对c-fos, c-jun mRNA及蛋白表达的影响。结果:1. 5 mg/L以上的DOX可以抑制A549细胞增殖(P < 0.01),该抑制作用呈时间剂量依赖效应。而2.5mg/L的DOX作用不著(P > 0.05)。2. 20、40 mg/L的DOX作用48 h后,电镜及荧光显微镜显示:A549细胞出现体积缩小,染色质边集,凋亡小体形成等细胞凋亡现象;DNA琼脂糖凝胶电泳出现典型的梯状条带,DOX剂量越大,条带越明显;AnnexinV-PI双染显示:0、10、20、40 mg/L DOX作用后,细胞凋亡率分别为2.22 %、5.86 %、12.6%、20.59%。3. 2.5、5、10 mg/L的DOX作用48 h后,其粘附率分别为81.6%、67.2%、55.3%,而对照组为96%。作用24 h后,2.5、5、10 mg/L的DOX对A549细胞在Matrigel上的移动抑制率分别为3.7%、10.8%、18.2%;作用48 h后,其移动抑制率分别为5.8%、20.2%、35.8%;5、10 mg/L的DOX可以抑制A549细胞在Matrigel上侵袭,其侵袭抑制率分别为12%、33%,而2.5 mg/L DOX对其无明显影响(P>0.05)。应用30 mg / kg / d DOX处理的裸鼠肺转移瘤结节数显著低于对照组。DOX组和对照组裸鼠肺表面转移瘤结节数分别为74±19个和15±35个,其转移抑制率达79%。4. 2.5、5、10 mg/L的DOX均可不同程度的抑制A549细胞基质金属蛋白酶2(MMP2)的活性,在10 mg/L时尤为显著。10 mg/L的DOX可抑制A549细胞MMP2的mRNA合成及蛋白表达。5.10 mg/L的DOX体外可以抑制A549细胞血管内皮生长因子(Vacular endothelial growth factor, VEGF)的表达。应用30 mg / kg / d DOX处理的裸鼠肺转移瘤中VEGF的表达明显低于对照组。6.10 mg/L的DOX可以抑制A549细胞c-jun mRNA及蛋白表达。结论1.药用剂量DOX可以抑制A549细胞体外增殖,大剂量可促其凋亡;2.药用剂量的DOX即可抑制A549细胞对细胞外基质Matrigel的粘附、移动及侵袭;安全剂量DOX可减少裸鼠肺转移瘤结节形成;3.药用剂量的DOX可以抑制A549细胞MMP2的活性、表达;DOX抑制A549细胞的生长、侵袭、转移作用可能与其抑制MMP2有关;4.药用剂量的DOX可以抑制A549细胞VEGF、c-jun的表达。DOX抑制MMP2的表达可能与其抑制VEGF、c-jun有关。AP1途径可能是DOX抑制MMP2和VEGF表达的一条通路。总之,本实验表明,DOX可能通过抑制MMP2的活性和表达抑制人肺癌细胞系A549细胞的生长及转移力。DOX至少可以作为辅助化疗药用于肺癌的治疗。