论文部分内容阅读
目的:探索不同中医治法防治肝癌的作用机制,深入研究肝癌大鼠中被健脾益气治法下调的泛素结合酶E2D2(UBE2D2)基因,及其在SMMC7721细胞恶性增殖的中的作用。
方法：
(1)在导师以往研究中发现的健脾益气等常用中医治法调节二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌组织的多基因差异表达的基础上,将22个能被不同中医治法下调的大鼠肝癌组织基因的cDNA序列编码区(CDS),与人类的基因组序列(或nr数据库)BLAST比对,以相应同源性最高的人类基因进行靶点选择并设计、合成插入片段;构建pSilencer2.1-shRNA表达载体;分别应用电转染技术、脂质体转染技术将其转染入人肝癌SMMC-7721细胞,以不含插入片段的载体为阴性对照;采用MTT法观察其对细胞增殖的作用,并通过RTqRCR检测口的基因表达的被降解程度;倒置相差荧光显微镜观察转染效率及这些基因表达沉默后肝癌细胞形态的变化;初步判断这些基因在肝癌细胞恶性增殖中的作用。
(2)选择以上具有促进细胞增殖的基因UBE2D2,采用U133 Plus GeneChip检测该基因表达沉默前后的SMMC-7721细胞基因表达谱变化;重点分析其对细胞凋亡、细胞周期等通路的影响。
(3)采用脂质体包裹UBE2D2 siRNA直接转染SMMC-7721细胞,观察其时效和量效作用,并综合采用RTqRCR等技术,观察该基因表达的降解程度并验证对若干与细胞凋亡、细胞周期等通路的相关基因的调节作用。
结果：
(1)22个入选大鼠基因中,有16个与人类相同:根据目的基因CDS区长度的不同分别选择了1～3个作用靶点并构建起45个pSilencer2.1-shRNA表达载体;成功将这些载体通过电转染和脂质体转染入SMMC-7721细胞,经多次重复实验和RTqRCR验证,发现UBE2D2等4个基因具有促进SMMC-7721细胞恶性增殖的作用。
(2)采用脂质体包裹psilencer2.1-UBE2D2 shRNA表达载体转染SMMC-7721细胞,并采用U133 Plus GeneChip检测,发现UBE2D2 RNAi后SMMC-7721细胞出现了大量的差异表达基因,主要涉及细胞凋亡、细胞周期等通路,但调整幅度不大。
(3)采用脂质体包裹UBE2D2 siRNA直接转染SMMC-7721细胞,发生了类似的UBE2D2降解现象,但对若干与细胞凋亡、细胞周期等通路基因的调节作用与pSileneer2.1-UBE2D2 shRNA表达载体有所异同。
结论：
(1)常用中医治法下调大鼠肝癌的16个基因中,筛选到对肝癌细胞恶性增殖具有促进作用的UBE2D2等4个基因。针对同一靶点的siRNA和shRNA均能降解UBE2D2。
(2)SMMC7721细胞的P53基因未发生突变,UBE2D2的作用可能通过加速对P53蛋白的降解,间接干预了细胞的增殖与凋亡,促进了细胞的增殖。
(3)鉴于SMMC7721细胞P53基因表达不活跃,以致UBE2D2基因表达的差异对该肝癌细胞恶性增殖的影响并不关键。但当该细胞转染质粒并大量复制后,以及G418等的综合作用,可能会激活P53蛋白及其通路,引发细胞凋亡、细胞周期等通路的改变,由此凸显了UBE2D2降解P53蛋白、促进肝癌细胞恶性增殖作用。直接转染UBE2D2的siRNA,因P53蛋白及该通路未被激活,导致UBE2D2基因RNAi作用不显著。
(4)因此,由载体介导的shRNA与直接转染的siRNA作用机制有一定的差别,互有利弊,选择时应引以注意。
(5)本研究有助于加深对中医不同治法在肝癌基因表达调控方面的作用机制的认识,丰富了肝癌发生与防治的分子机理方面的知识,并为今后肝癌防治研究中筛选分子靶点提供经验。