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问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)感染引起的钩端螺旋体病(Leptospirosis)是世界范围流行的自然疫源性的人兽共患病，也是各国发生洪涝时重点监控的传染病。钩体血清群众多，各群间交叉保护作用较弱或无，不同地区流行的优势钩体血清群、型有明显差异，故目前国内外均采用当地流行的主要钩体血清群、型来制备多价钩体疫苗，但对疫苗中未包含的其它钩体血清群感染保护作用极其有限。近年来，我国不少地区出现了“南黄北移”和赛罗群棉兰型的流行。此外，目前仍然普遍使用的钩体全细胞多价死疫苗接种后副作用较大，不易被人们接受而影响其推广和应用。不少地区人群对当地流行的钩体优势菌群的特异性免疫力明显下降，已存在钩体病大规模爆发流行的潜在危险。因此，寻找钩体属特异性保护抗原，进而研制属特异性基因工程疫苗，对于预防和控制钩体病的流行具有重要意义。 业已证实，经80℃灭活、生理盐水回收的腐生性双曲钩体三堡垄群patoc型Patoc Ⅰ株，能与所有钩体病患者血清抗体发生凝集，表明存在钩体属特异性抗原，但其抗原性质不明。Haake等(1993)首先从流感伤寒群钩体基因组DNA中鉴定了一个全长963 bp、编码320个氨基酸穿膜蛋白的ompL1基因，并用Southern杂交证实该基因存在于多群问号钩体的基因组DNA中。Haake等(2000)报道4群5型问号钩体基因组DNA中均存在编码主要外膜蛋白(major outer membrane protein，MOMP)的lipL32基因，该基因大小为819 bp，编码272个氨基酸的外膜脂蛋白。浙江大学硕士学位论文钊守风 众所周知，不同国家和地区流行的优势钩体血清群往往有很大差异。最近我们的研究结果证实，我国主要钩体血清群中，。mpLI基因至少可分为3个基因型，其中。mPLI八基因型含有秋季群、流感伤寒群和赛罗群，。mpLI几基因型含有黄疽出血群、犬群、澳州群、波摩那群和七日热群，具有。mpLll3基因型的钩体均为国内非主要流行的钩体血清群，但重组ompLI/l基因型表达产量(30%)高于。mPLI左基因型(20%)，且两者兔抗血清的交叉显微镜凝集试验(microscoPieagglutination test，MAT)效价均为卜1 6-128。我国主要钩体血清群中，liPL32基因可分为两个基因型，lipL32/l基因型包含了黄疽出血群、秋季群、波摩那群、流感伤寒群、七日热群和赛罗群等10群我国主要流行的钩体血清群，且liPL犯八基因型表达产量(40%)明显高于liPL32/2基因型(10%)。 尽管基因工程疫苗具有诸多优点，但存在抗原单一而免疫保护效果较差、生产成本较高的缺点。采用基因工程技术将liPL32八和。mpLlll两个基因融合，构建liPL”/I一口仰乙I/I融合基因的表达系统，可以减少生产工序、降低生产成本，并有可能提高表达产物的抗原性。通常以大肠杆菌为表达宿主菌的原核表达系统具有操作简便、表达产量较高的优点，但也常存在以包涵体形式存在的目的蛋白变性及产品易被内毒素污染等缺点。通常以毕赤酵母(P.pastoris)为表达宿主菌的真核表达系统易表达可溶性或分泌性重组目的蛋白、不含内毒素，但操作烦琐、不易筛选到高产量的工程菌株。 本研究中，我们采用自行设计的连接引物PCR构建了lipL32八一。mpLI/l融合基因，建立了lipL32八一ompLI八融合基因的大肠杆菌原核表达系统和毕赤酵母真核表达系统，采用W七stem blot鉴定了原核表达产物的免疫性，以期为进一步研制属特异性钩体基因工程疫苗及其产业化奠定基础。 材料和方法 1.胜合基因的构建 根据llpL32八和。mPLI/l基因型序列设计连接引物，采用PcR构建IIPL刃/I一口即乙I/I融合基因。为了能在真核表达系统中采用较为便利的Ni一TA亲和层析法收集表达的目的重组蛋白，在下游引物中加入6xHis的序列。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，目的扩增产物的预期大小为1776bP(原核表达)和1794bP(真核表达)。浙江大学硕士学位论文钊守凤 2.核普酸序列洲定 采用T-A克隆法构建p〔Ic知一T-liPL了2/I一口即乙I/I重组质粒，碱变性法提取阳性克隆菌落的质粒，双酶切进行初步鉴定，双脱氧链末端终止法测定插入片段的核昔酸序列。 3.原核表达系统的构建 采用EcoRI和众。1双酶切pUCm一T-liPLJZ/I一。即乙IH和表达质粒pET-32a，目的片段经回收后连接。将重组原核表达载体pET-了ZaJ御乙了2/I一。即乙I/I转化于E.eoli BLZIDE3表达宿主菌中，构建PET-了Za一liPLJZ/I一即Ll/I一E.coliB艺ZIDE3原核表达系统，碱变性法提取质粒后再次测序。 4.真核表达系统的构建和筛选 采用EcoRI和Notl双酶切pUCm一T-liPL了2/I一口即乙I/I和质粒尸月心夕犬，目的片段经回收后连接。将重组真核表达载体尸尸犯夕称伽乙JZ/I一口仰乙I/I转化于E.coliDHSQ。碱变性法提取白色菌落的重组质粒再次测序。重组质粒用Sall线性化后，用电击转化入P. pastorisGSj”表达宿主菌中。用MM和MD平板分离His+Mut+型或His+ Muts型菌落，再用G418+YPD平板筛选出高抗性的His+ Mut+转化子，构建ppICgK一lipL32/l一ompLI八一Ppast