研究背景控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation, COH)作为体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET)的首要步骤和关键环节,在高获卵率的同时,临床妊娠率并不理想,这与COH过程产生超生理剂量的雌、孕激素密切相关。目前国内外普遍认为COH过程中的超生理量雌、孕激素可导致机体凝血相关因素变化,引起微循环不同程度的障碍,从而引发种植失败、反复流产等不良妊娠事件的发生。目前国内外针对反复着床失败或有不良妊娠史的患者开始着重探究凝血/纤溶系统对胚胎着床的影响,有学者开始探究使用抗凝药物对改善临床结局的作用,目前主流观点认为针对反复着床失败或不良妊娠史的患者,在排除其余可能引起流产的原因后,若在促排同时或胚胎移植同时适当进行抗凝治疗有助于改善临床结局,但具体作用机制目前暂未明确。对纤溶过程中特别是D-二聚体这方面,无论是国内外,目前主要研究着力点还是在正常妊娠人群或者正常月经周期上,特别是在IVF过程中需要进行COH的人群,还没有系统、严谨的临床研究,因此展开相关研究十分必要。目的1.以自然周期冻融胚胎移植组为对照,观察来曲唑促排卵周期冻融胚胎移植组、控制性超排卵COH(黄体期长方案组)前后的血浆D二聚体浓度改变。2.比较不同促排方案对D二聚体的影响程度是否相同以及D二聚体的改变与雌孕激素的相关性。3.初步探索D-二聚体与胚胎着床相关性。方法1.研究对象：2014年5月至2015年12月在南方医科大学附属中山市博爱医院生殖中心就诊的不孕妇女。1.1纳入标准：20-35岁,月经周期规则,BMI 18～23,基础性激素正常(E2：20-60pg/ml、P<1ng/ml、FSH<10mIU/ml、LH<10mIU/ml)。1.2排除以下任何可能影响血浆D-二聚体水平的因素：高血压；糖尿病；血栓栓塞性疾病个人史或家族史；凝血功能异常；恶性肿瘤；心血管疾病(如急性心机梗死、不稳定性心绞痛、动脉粥样硬化等)；脑血管疾病；肝、肺、肾、胰疾病；自身免疫性疾病；甲状腺功能减退症；30天内有感染,且体温大于37.5℃；30天内有手术或者外伤；半年内有输血史；采血前一天处于应激状态；正在服用可能影响凝血、纤溶系统的药物；曾有异常流产史或胎儿发育异常史。2.分组2.1自然周期冻融胚胎移植组：月经规则患者自然周期监测排卵,视冷冻胚胎质量、按照卫生部规定移植2～3枚冷冻胚胎。胚胎移植后用黄体酮40mg im Qd进行黄体支持,移植后两周验血β-HCG确定妊娠。2.2来曲唑促排卵冻融胚胎移植组：月经周期第3-5天开始用药,视患者体重予来曲唑(letrozole tablets)(来曲唑片(?),伊美舒(?),浙江海正药业股份有限公司)2.5-5 mg/d共5天,视卵泡发育情况予肌注HMG,至卵泡直径18-22mm时肌注绒毛膜促性腺激素(HCG)5000-10000U,确定排卵后3天则按照卫生部规定移植冻融胚胎2-3枚。胚胎移植后用黄体酮40mg im Qd进行黄体支持,移植后两周验血β-HCG确定妊娠。2.3黄体期长方案组：第1周期行IVF,使用统一的黄体期长方案：排卵后5-7天长效促性腺激素激动剂(gonadotrophin releasing hormone agonist, GnRH-a(达菲林(?),Diphereline(?),IPSEN PHARMA BIOTECH) 1.2-1.3mg降调节,促性腺激素(gonadotrophin,Gn)(果纳芬,GONAL-f(?),MerckSeronoS.p.A) 150-225IU启动,至卵泡成熟予肌注HCG(注射用绒促性素,Chorionic Gonadotrophin for Injection,丽珠集团丽珠制药厂)10000IU,注HCG后34-38小时取卵,取卵后进行常规体外授精、胚胎培养。取卵后3天,选取较好胚胎进行移植,按照卫生部规定移植2-3枚胚胎。胚胎移植后用黄体酮40mg im Qd进行黄体支持,移植后两周验血β-HCG确定妊娠。3.实验室方法3.1血浆D-二聚体测定采用胶乳免疫比浊法实验操作,使用思塔高STA-R型自动分析仪,由日本积水医疗株式会社提供检测血浆D-二聚体检测试剂盒。批内精密度测定变异系数(CV)<4%,批间精密度测定CV<4%。室间差异<3%。3.2凝血4项均采用凝固法操作,使用斯塔高系列凝血分析仪,由斯塔高公司提供试剂盒。3.3血清雌二醇、孕酮、FSH、LH、β-HCG使用化学发光法操作,使用Unicel Dxi800 Access免疫分析系统,由贝克曼而特公司提供试剂盒。3.4血常规使用光散射和细胞化学染色联合法操作,使用Bayer公司DVIA120型血细胞分析仪,由拜耳公司提供试剂盒。严格按照试剂盒说明操作,室内、室间质控达标。4.统计学方法：统一使用SPSS 20.0统计软件进行数据统计分析,P<-05表示配对差值的总体中位数不为0或相关系数有统计学意义。4.1对自然周期冻融胚胎移植组、来曲唑促排卵冻融胚胎移植组及黄体期长方案周期各组内对比：time1与time2的配对观察指标使用配对样本的Wilcoxon符号秩检验。采用重复测量数据的方差分析来检验3个时间点间各观察指标的差异。使用Spearman等级相关检验time3(和黄体期长方案组内time2)D-二聚体与各观察指标的相关系数。根据是否怀孕对病例进行分组,对妊娠组及非妊娠组组间对应观察指标用两独立样本的Wilcoxon符号秩检验。4.2三组间对比：在三组之间对基础资料行组间方差分析提示,基础FSH在三组间存在统计差异(P<0.05),差异为微刺激组分别与自然周期冻融胚胎移植组、黄体期长方案之间,因此在三组之间对同一观察指标以基础FSH为协变量行组间协方差分析,P<0.05表示同一观察指标在三组间存在统计差异,对P<0.05的观察指标进一步使用SNK法检测各组间差异。研究内容1.自然周期冻融胚胎移植组：于自然周期月经干净2-3天(time1)、排卵日(time2)及冷冻胚胎移植后第14天(time3)抽取空腹静脉血检测D-二聚体、凝血4项(TT,APTT,PT,Fib)和血常规,比较3个时间点D-二聚体、凝血4项和血常规的变化,了解上述指标与胚胎着床的关系。记录患者一般情况、基础性激素、排卵日性激素、移植胚胎数及查孕日性激素。探讨血浆D-二聚体浓度与上述指标的相关性。2.来曲唑微刺激冻融胚胎移植方案组：于微刺激周期前一月经周期月经干净2-3天(timel)、HCG日(time2)及冻融胚胎移植后第14天(time3)抽取空腹静脉血检测D-二聚体、凝血4项(T,APTT,PT,Fib)和血常规,比较3个时间点D-二聚体、凝血4项和血常规的变化,了解上述指标与胚胎着床的关系。记录患者一般情况、基础性激素、来曲唑用量和总Gn用量、成熟卵泡数、黄体支持总剂量及查孕日激素。探讨血浆D-二聚体浓度与上述指标的相关性。3.黄体期长方案组：于促排前一月经周期月经干净2-3天(time1)、超促排周期HCG日(time2)及新鲜周期胚胎移植后第14天(time3)抽取空腹静脉血检测D-二聚体、凝血4项(T,APTT,PT,Fib)和血常规,比较COH前后D-二聚体、凝血4项和血常规的变化,了解上述指标与胚胎着床的关系。记录总促卵泡素(Gn)用量,取卵日总卵泡数(ALOKA SSD-3500型超声仪,探头频率7.2MHz,日本)、成熟卵泡数、获卵数,HCG日E2、P,黄体支持总剂量,探讨COH后及查孕日血浆D-二聚体浓度与上述指标的相关性。4.横向对比探究三种方案之间D-二聚体的变化是否存在规律及其与妊娠的关系。结果1.自然周期冻融胚胎移植组1.1入组49例各观察指标比较提示,D-二聚体在time 1 (0.46(0.20,1.16)μg/ml)及time2(0.45(0.20,1.09)μg/ml)变化无统计学意义(Z=-0.432,P=0.666),凝血4项中的PT及血常规WBC在排卵日均比基础状态升高(P<0.05)。其余观察指标在基础状态与排卵日的变化无统计学意义。其中26例于查孕日资料完善,timel、time2及time3之间各观察指标比较提示,D-二聚体(time1 0.46(0.20,1.16)μg/ml,time2 0.45(0.20,1.09)μg/ml,time30.74(0.21,1.64)μg/ml, F=9.762,P<0.001)及凝血4项的Fib在3各观察时间点之间的差异有统计学意义(P<0.01),血常规的VVBC、HGB、 PLT、HCT、MPV在3个观察时间点之间的差异有统计学意义(P<0.05)。1.2与time3 D-二聚体相关系数有统计学意义的为time2 E2 (rs=0.424,P<0.05)。1.3对time3 26例患者根据是否胚胎着床进行分组并对组间进行各观察指标的对比,time3血浆D-二聚体(妊娠组0.66(0.21,1.64) μg/ml,非妊娠组0.82(0.56,1.22)μg/ml,非妊娠组高于妊娠组,但差异无统计学意义)、凝血4项及血常规在两组间差异均无统计学意义(P>0.05)。2.来曲唑微刺激冻融胚胎移植组2.1入组27例各观察指标比较提示,D-二聚体在time 1 (0.43(0.20,0.98)μg/ml)及time2(0.32(0.20,0.73)μg/m)变化有统计学意义(Z=-3.626,P<0.001)。凝血4项中的APTT在time2较基础状态下降(P<0.01)。血常规WBC、PLT和PCT在time2均比time1升高(P<0.05)。其中18例于time3资料完善,D-二聚体(time1 (0.42(0.27,0.98)μg/ml),time2(0.30(0.20,0.73)μg/ml),time3(0.80(0.41,1.56)μg/ml))及凝血4项的Fib在3各观察时间点之间的差异有统计学意义(P<0.01),血常规的WBC在3个观察时间点之间的差异有统计学意义(P<0.05)。2.2与time2 D-二聚体相关系数有统计学差异的观察指标为成熟卵泡数(rs=-0.436,P<0.05)。与time3 D-二聚体相关系数有统计学差异的观察指标为time3β-HCG (rs=-0.495, P<0.05)及time3 P(rs=-0.778,P<0.01)。2.3对time3 18例患者根据是否妊娠进行分组并对组间进行各观察指标的对比。Time1 D-二聚体(妊娠组0.31(0.27,0.65)μg/ml,非妊娠组0.65(0.31,0.98)μg/ml)及time3凝血4项的APTT在两组间差异有统计学意义(P<0.05),time2 D-二聚体、time3 D-二聚体及血常规在两组间差异均无统计学意义(P>0.05)。3.黄体期长方案组3.1入组169例入组病例中,D-二聚体(time1 (0.42(0.10,1.70)μg/ml), time2(0.56(0.20,3.14)μg/ml))、凝血4项中的PT.Fib及血常规WBC、HGB在time2均比timel升高(P<0.01)。血常规RBC、HCT、PLT、PCT和凝血4项中的APTT、TT在time2均比timel降低(P<0.01)。其中73例行新鲜周期胚胎移植,除外血常规的PDW和凝血4项的PT,其余所有指标在time1、time2及time3之间的差异均有统计学意义(P<0.05)(其中D-二聚体time 1(0.44(0.20,1.70)μg/ml), time2(0.51(0.24,1.53)μg/ml),time3(1.07(0.20,4.38)μg/ml),F=60.944,P<0.001)。3.2与time2 D-二聚体相关系数有统计学差异的观察指标为time2 E2(rs=0.160, P<0.05)。通过相关分析未能发现与time3 D-二聚体相关系数有统计学意义的观察指标。3.3在time3根据是否妊娠分组,血浆D-二聚体及凝血4项在两组间差异均无统计学意义(P>0.05)(妊娠组D-二聚体1.14 (0.20,4.38) μg/ml,非妊娠组D-二聚体1.07 (0.35,1.91)μg/ml),血常规中的WBC、PCT在两组间差异有统计学意义(P<0.05),其余指标在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。4.三组间对比4.1Time1 D-二聚体在三组间无统计学差异(自然周期冻融胚胎移植组0.46(0.20,1.16) μg/ml,来曲唑促排卵冻融胚胎移植组0.43(0.20,0.98) μg/ml,黄体期长方案组0.42(0.10,1.70) μg/ml),在time2 (自然周期冻融胚胎移植组的排卵日、来曲唑促排卵冻融胚胎移植组及黄体期长方案组的HCG日)及time3(三组的查孕日)三组间差异有统计学意义(P<0.01)。凝血4项的APTT、Fib及TT在time2三组间差异具统计学意义(P<0.05)。其余指标在对应监测时间内、三组间均无统计学差异(P>0.05)。4.2血常规的WBC在time2及time3三组间差异具统计学意义(P>0.01),均为黄体期长方案组与其余两组间差异有统计学意义。HGB、PLT、HCT、PCT在time2三组间差异具统计学意义(P<0.01),均为来曲唑冻融胚胎移植组与黄体期长方案组间差异有统计学意义。其余指标在对应监测时间内、三组间均无统计学差异(P>0.05)。结论1.自然周期冻融胚胎移植组内查孕日D-二聚体较基础状态升高。来曲唑促排卵冻融胚胎移植组内基础、HCG日及查孕日呈先下降后升高的趋势。黄体期长方案组内基础、HCG日及查孕日D-二聚体均逐次升高。以自然周期为对照,来曲唑促排卵冻融胚胎移植组及黄体期长方案组内D-二聚体变化规律不同,可能与不同促排卵方案中性激素变化水平不同有关。2.自然周期冻融胚胎移植组内查孕日D-二聚体与排卵日E2相关。来曲唑促排卵冻融胚胎移植组内HCG日D-二聚体与成熟卵泡数呈负相关,查孕日D-二聚体与β-HCG及P呈负相关。黄体期长方案组内,COH过程使血浆D-二聚体上升且与HCG日E2呈正相关。不同促排卵方案中,与D-二聚体变化相关的指标不同,但总体可归因于治疗中使用的促排卵药物或黄体支持药物,引起体内雌孕激素改变、进而影响凝血纤溶系统的改变。3.按查孕日是否妊娠分组,自然周期冻融胚胎移植组内两组间基础、排卵日及查孕日D-二聚体差异无统计学意义；来曲唑促排卵冻融胚胎移植组内两组间基础D-二聚体非妊娠组高于妊娠组,但两组间HCG日及查孕日D-二聚体无差异；黄体期长方案组内两组间治疗前、HCG日及查孕日D-二聚体均无差异,虽不能提示D-二聚体与胚胎着床之间有相关关系,但影响胚胎着床原因众多,本研究未能对这些原因对进行均衡,这是本研究不足之处,往后若能继续完善实验设计,期待能能详尽探讨D-二聚体与妊娠的关系。4.通过横向对比探究三种方案之间D-二聚体的变化,观察到随着不同处理方案的改变,自然周期冻融胚胎移植组和来曲唑微刺激冻融胚胎移植组内,虽然D-二聚体均有变化,但波动范围不大；而在黄体期长方案组内D-二聚体波动范围较其余两组广,且与COH过程中产生超生理剂量的E2相关,提示COH过程中性激素变化剧烈可引起机体凝血/抗凝/纤溶系统活跃,继发性引起D-二聚体的波动。综上,COH过程中的大剂量的促排卵药物与黄体支持药物的使用,产生超生理量的雌、孕激素可导致机体血浆D二聚体的明显改变。目前临床上使用促排卵药物前应注意排除潜在血栓形成风险,使用促排卵药物时应注意监测D-二聚体,警惕血栓栓塞性并发症发生。目前本研究未能得出D-二聚体与妊娠的相关性,往后若能继续完善实验设计,增大样本量,期待可更加详尽探究D-二聚体与妊娠的关系。