研究背景和目的宫颈癌是世界上第二大常见的妇科肿瘤,尤其是在发展中国家。在发达国家,每10万妇女发现有10个宫颈癌患者,而在某些发展中国家每10万妇女发现有60个宫颈癌患者。绝大多数的宫颈癌由宫颈上皮内瘤样病变(cervical intra-epithelial neoplasia, CIN)逐渐发展而来。CIN是局限于宫颈上皮内,具有不同的组织学改变的宫颈癌前病变,从CIN发展到浸润癌大约需要10年的时间。如果在CIN或早期浸润癌阶段就能及早发现并给以极积治疗,治愈的机会非常高。因此,为了降低宫颈癌的发病率和死亡率,迫切地需要建立有效的宫颈癌筛查方案,尤其是在发展中国家。细胞学检查和人类乳头状瘤病毒DNA检查是世界卫生组织强力推荐的宫颈癌筛查方法。据报道,在一些采取了有组织的筛查方法的国家,传统细胞学涂片检查已经降低了70%以上宫颈癌的发生率。尽管如此,细胞学涂片检查的灵敏度低、假阴性率高、检测结果不稳定。与传统的细胞学涂片相比,液基细胞学检查方法的应用增加了人群筛查的效能但并没有显著提高其灵敏度。由于细胞学检查的灵敏度低,一些癌前病变不能被早期发现,因而得不到有效的治疗而进展为浸润性宫颈癌。HPV感染是宫颈癌发生的必需因素,99.7%的浸润性宫颈癌中可以发现HPV的感染。目前为止,100多种HPV被鉴定出来,大约13种HPV (16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82)被鉴定为高危型,它们可以转化生殖道上皮细胞并能引起浸润性宫颈癌。在这些高危型HPV中,最常见的是HPV16和18,与宫颈癌的发展密切相关。高危型HPV感染和宫颈癌发展的因果关系使得HPV检查具有了宫颈癌筛查的潜在作用。HCⅡ是美国食品和药物管理局推荐的HPV DNA的检测方法,能一次性检测出18种HPV,包括13种高危型别(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82型)和5种低危型别(6,11,42,43 and 44型),但是不能鉴定是哪一型别的HPV存在,也不能区别是暂时感染还是持续感染。有趣地是,大多数HPV感染是暂时感染,机体可以将其自发清除而不能引起CINⅡ以上的病变,而只有高危型HPV的持续感染才能导致宫颈癌的发生。HPV DNA检查用于筛查CINⅡ以上宫颈病变具有更稳定更灵敏的优点,但特异性不如常规细胞学检查方法高。这是因为大多数HPV感染是暂时感染,机体可以自发清除而不引起CINⅡ以上宫颈病变。只有高危型HPV的持续感染(占HPV感染的10-20%)才能引起宫颈癌的发生。因此,需要找到更特异的生物学标记来增加CINⅡ以上病变筛查的特异性。这也许会使得暂时感染高危型HPV的妇女特别是细胞学检查结果正常的妇女避免进行不必要的随访。这也可能会减少对某些患者的过度诊断和治疗。除了高危HPV感染,一些染色体异常和基因组不稳定性变化是癌前病变进展为浸润性宫颈癌的必要途径。在这些异常变化中,最常见的畸变是3q26的扩增,该区域包含人端粒酶RNA基因(TERC基因),70%左右的宫颈癌中发现有该染色体区域的异常扩增。端粒酶通过提供端粒稳定性和调节端粒长度来维持染色体的稳定。端粒酶主要由两个部分组成,一个是RNA亚单位为端粒重复序列提供模板,一个是蛋白亚单位催化端粒酶的合成。TERC基因编码端粒酶RNA单位来维持细胞分裂时端粒的长度。当TERC基因过表达时,细胞可以逃避凋亡而导致癌症的发生。最近的一些研究发现：采用荧光原位杂交技术检测TERC基因,结果发现该基因的扩增频繁地出现在宫颈鳞状细胞癌、高度宫颈上皮内瘤变及低度宫颈上皮内瘤变中且扩增频率随着宫颈病变严重程度的增加而增加,表明TERC基因可能是宫颈癌筛查的一个有效分子标志。Alameda F等研究发现,FISH检测3q26扩增可以作为低度宫颈上皮内瘤变病人持续或进展的预测指标。可见,对TERC基因扩增的检测有助于宫颈癌的筛查及早期诊断。目前,荧光原位杂交(fluorescence in hybridization, FISH)技术被认为是检测这一基因扩增的标准方法。FISH技术操作简单、重复性好、稳定性高,并具有较好的灵敏性及特异性,因此很适合于临床检测。目前已广泛应用于细胞遗传学、肿瘤生物学、基因定位、基因扩增和产前诊断等领域。在本研究中,我们采用荧光原位杂交技术检测宫颈脱落上皮细胞hTERC基因扩增情况,并与细胞学、HPV结果、病理学结果比较,评估TERC基因检测对于宫颈癌筛查及CIN病情进展风险预测的临床意义,从而为中国妇女宫颈癌的筛查、早期诊断及预后评估提供新的途径。方法/材料收集南方医科大学附属南方医院2008年3月至12月的门诊接受筛查者或接受治疗前的住院患者120例,并取得患者的知情同意。所有的研究对象均排除急性感染、妊娠、手术切除及放化疗史。对每一位研究对象进行TERC基因的FISH检测,HPV DNA检测、细胞学检查和组织病理学检查。从宫颈鳞柱交接部采集脱落上皮细胞,然后将其贮存在液基细胞学专用储存瓶和HPV专用储存瓶中用于FISH检测和HPV检测。根据细胞学检查结果,120名研究对象分为正常21例、ASCUS 8例、ASCH 5例、LSIL 22例、HSIL 52例和SCC 12例。根据组织病理学结果,120名研究对象分为正常20例、CINⅠ14例、CINⅡ35例、CINⅢ36例和宫颈癌15例。结果TERC基因扩增的阳性率在正常、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌组中分别是0.00%、7.14%、65.71%、97.22%和100.00%。不同宫颈病变组,TERC基因扩增阳性率有显著差异(P<0.01),随宫颈病变程度加重,TERC基因扩增阳性率显著增高。除正常组与CINⅠ、CINⅡ/Ⅲ与宫颈癌组之外,其余各组两两比较差异均有统计学意义(P<0.005)。TERC基因扩增阳性的异常细胞平均数在正常、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌组中分别是0.70、3.57、10.97、17.86和35.87。不同宫颈病变组,TERC基因扩增的异常细胞平均数有显著性差异(P=0.000),随宫颈病变程度加重,TERC基因扩增阳性的异常细胞数增多。组间两两比较,各组异常细胞数差异均有统计学意义(P=0.000)。宫颈病变程度越高,TERC基因扩增阳性的异常细胞的核型表现越复杂。在正常对照组,异常信号的模式只有2:3(CSP3:TERC)一种。在CINⅠ组,异常信号的模式是2:3和2:4,分别占总的异常信号的82%和18%。在CINⅡ或更高病变组,出现了2:5,4:4,5:5,6:6和更复杂的信号类型,且复杂信号类型的比例增加。在SCC组中,出现更复杂的异常信号的模式,如2:5,5:5,6:6,其中,5:5信号类型占总的异常信号模式的22.3%。以FISH结果阳性为标准诊断CINⅡ及以上宫颈病变的敏感性和特异性分别是84.9%、97.1%。以HPV DNA检测结果阳性为标准诊断CINⅡ及以上宫颈病变的敏感性和特异性分别是96.5%、52.9%。与HPV-DNA检测比较,FISH检测诊断CINⅡ及以上宫颈病变的特异性显著提高而敏感性并没有明显降低。结论TERC基因的异常扩增在宫颈癌的发展过程中起重要作用。采用FISH技术检测TERC基因扩增,具有较高的灵敏度和特异度,在宫颈癌及其癌前期病变的筛查和早期诊断中有重要临床价值。在细胞学检查和HPV检测筛查宫颈癌的同时,采用FISH技术检测TERC基因扩增,可以显著提高筛查的特异度而不明显降低其灵敏度,有望成为辅助宫颈癌及癌前病变诊断及预测癌前期病变是否向宫颈癌进展的重要指标,为宫颈癌的临床诊断和治疗提供更多的依据。此外,FISH检测TERC基因可以有效地对不同级别的CIN进行区分,因此可以作为一个可靠的检测手段辅助CIN级别的明确诊断,指导CIN的合理治疗。